【研究背景】烟草是重要的经济作物,其在大田生长期对水分需求较多,易受干旱的影响,从而导致烟叶产量和品质的损失。钾是重要的渗透调节物质,能够通过调节气孔的开闭,参与植物的干旱胁迫响应。植物的TPK/KCO钾离子通道蛋白,对钾离子具有高度的选择透性。例如,拟南芥的TPK1在植物中广泛表达,可调节气孔开闭,对维持细胞内钾离子动态平衡以及种子的萌发起到重要的作用。研究还表明,该通道家族蛋白具有响应盐胁迫及低钾胁迫的功能。然而,目前尚不清楚其是否参与植物的干旱胁迫响应。本课题组前期研究发现,在模拟干旱条件下,属于烟草TPK/KCO钾离子通道家族的NtTDRE1基因的表达量显著上升,暗示其可能参与了烟草的干旱胁迫响应。因此将该基因克隆出来,并创制了NtTDRE1过表达和敲除突变体株系。然后对野生型、过表达及敲除突变体材料进行了干旱胁迫处理,开展了形态观察、生理指标测定及抗旱相关Marker基因的表达分析等,筛选并验证NtTDRE1的互作蛋白MDV3100,旨在为NtTDRE1参与烟草干旱胁迫响应的功能与调控机制研究奠定基础。【材料与方法】采用野生型、NtTDRE1过表达和敲除突变体株系为研究材料,观察不同浓度的PEG6000和ABA处理下种子的萌发率。同时,用适当浓度的PEG6000和ABA处理烟苗,分析抗旱相关基因的表达变化;再对各个材料的烟苗进行自然干旱处理,记录植株形态变化,并测定抗旱相关生理指标;制备NLGK-974体内tTDRE1的多克隆抗体,通过免疫沉淀-质谱鉴定(IP-MS)筛选其互作蛋白,并利用酵母双杂交、荧光素酶互补实验加以验证。【结果与分析】模拟干旱条件下,随着PEG6000的浓度增加,野生型、NtTDRE1过表达和Rumen microbiome composition敲除突变体的种子萌发率均呈现下降趋势,且在10%PEG6000的处理下差异较大,过表达株系的种子萌发率高于野生型和敲除突变体;随着外源ABA的处理浓度的增加,三组材料的种子萌发速度都有所减慢,且在1μM ABA处理下,过表达的种子萌发率显著低于野生型和突变体;在10%PEG6000、1μM ABA处理下,在过表达材料中抗旱相关基因的表达有所增强。将长势一致的2月龄烟草进行自然干旱30d后,过表达材料的保水力显著高于野生型,突变体材料失水最快。过表达材料的抗氧化酶活性、根冠干重、相对含水量都高于野生型和突变体,而其离体叶片失水率、气孔开度、过氧化氢和丙二醛含量则都低于野生型和突变体。为了寻找NtTDRE1的互作蛋白,在成功制作多克隆抗体的基础上,开展了免疫共沉淀试验。通过质谱分析,找到了候选蛋白Nt14-3-3。然后,分别利用酵母双杂交、荧光素酶互补试验验证了NtTDRE1与Nt14-3-3可以在体外与体内进行互作。同时,qRT-PCR的分析结果也表明,Nt14-3-3基因的表达受干旱胁迫的强烈诱导。【结论】NtTDRE1参与了烟草的干旱胁迫响应过程,并可能与Nt14-3-3蛋白协同作用,增强了烟草抵御外界干旱胁迫的能力。