目的:真菌性角膜炎具有高致盲危险,其诊断和治疗仍有巨大挑战性。传统滴眼液给药通常由于眼固有屏障限制药物吸收、泪液周转等药物去除机制引发药物浓度迅速降低以及药物的不受控制释放引起的副作用等原因导致治疗效果不佳。研究表明活性氧(Reactive oxygen species,ROS)诱导的氧化应激和炎症是角膜组织坏死的主要原因,减少ROS和炎症反应是开发真菌性角膜炎药物的重要目标。因此,本研究拟构建一种双亲性ROS响应性可控释放纳米载药滴眼液以提高抗真菌药物伏立康唑(Voriconazole,VOR)的角膜渗透性和生物利用度,并增强其对真菌性角膜炎的治疗作用。方法:(1)乙二醇壳聚糖-苯硼酸酯纳米载药系统(GC-EB-VOR)的制备和表征:将苯硼酸酯(4-carboxyphenylboronic acid pinacolate,EB)与乙二醇壳聚糖(Glycol chitosan,GC)共价结合形成ROS响应性纳米载体(GC-EB),通过包载VOR自组装形成双亲性ROS响应性载药系统。采用透射电镜(Transmission MRTX1133体内electrPuromycin化学结构on microscopy,TEM)、动态光散射(Dynamic light scattering,DLS)和热重分析(Thewildlife medicinermogravimetric analysis,TGA)等表征方式测定GC-EB-VOR纳米药物的形貌、电位、官能团性质和热稳定性。(2)GC-EB-VOR纳米药物的ROS响应可控释放性分析:采用高效液相色谱(High-performance liquid chromatography,HPLC)测量药物的包载率、载药量并分析ROS响应后药物累计释放率。TEM观察ROS响应后GC-EB-VOR纳米药物的形态。(3)GC-EB-VOR纳米药物的生物安全性、抗炎及抗菌效果分析:采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法进行生物安全性评价。细胞摄取实验及溶酶体荧光染色分析纳米药物细胞内分布状况。DCFH-DA荧光探针法检测细胞内GC-EB-VOR对ROS的响应和清除。蛋白免疫印迹(Western blot)试验和实时荧光定量PCR(Realtime PCR)分析纳米药物干预后细胞内炎症因子表达水平。吸光度测定和平板计数实验探究纳米药物对真菌的抑制作用。(4)真菌性角膜炎小鼠模型构建及GC-EB-VOR的干预效果评价:标准镰刀菌菌株感染C57BL/6J小鼠建立真菌性角膜炎模型,纳米药物滴眼干预后,每两天采用裂隙灯拍照观察各组感染情况,临床评分法评估角膜炎症程度。HE染色评价角膜组织学变化。酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法探究角膜中TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平。DHE免疫荧光染色分析纳米药物处理后角膜内ROS的含量。结果:(1)本研究成功构建了双亲性的ROS响应性GC-EB-VOR纳米载药系统,TEM观察到GC-EB-VOR呈均匀球形,DLS测得Zeta电位呈正电位有利于纳米药物和细胞膜的结合而提高纳米药物的角膜渗透。TGA分析揭示了纳米药物良好的热稳定性。(2)该纳米载药体系的包封率约为96%,载药量达77%,响应ROS的能力具有明显的浓度依赖性,在低ROS浓度刺激下1小时内药物累计释放量占释放总量的大部分。(3)生物安全性评价表明GC-EB-VOR处理后细胞活力仍维持在80%以上,纳米药物能被人角膜上皮细胞(Human corneal epithelial cells,HCECs)有效摄取并通过溶酶体途径运输。DCFH-DA荧光强度随药物剂量逐渐增加而降低揭示了GC-EBVOR良好的响应并清除ROS的效应。Western blot和Real-time PCR实验表明GCEB-VOR干预后显著降低炎症因子水平。吸光度测定和平板计数实验结果显示GCEB-VOR处理组对常见致病菌(镰刀菌和烟曲霉菌)都有明显的抑制作用。(4)小鼠镰刀菌感染5天后,裂隙灯拍照观察到GC-EB-VOR处理组与PBS处理组相比角膜炎症反应明显减轻,临床评分显著降低。HE染色各组炎症程度与裂隙灯拍照结果一致。ELISA结果表明炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达显著降低。DHE免疫荧光染色显示出GC-EB-VOR组相较于PBS对照组有最低的荧光表达。结论:上述研究结果表明我们所研制的双亲性GC-EB-VOR纳米载药滴眼液具有高角膜穿透性和良好的角膜滞留性,在低浓度ROS下实现药物的可控释放,高效响应和消除ROS并抑制炎症反应,最终达到良好的抗真菌效果,为开发纳米药物以提高滴眼液对真菌性角膜炎的治疗效果,降低失明风险提供了新策略。