醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)超家族是一类活性依赖于NAD(P)~+的多功能酶蛋白,可催化内源性和外源性醛发生不可逆的氧化反应而转变为相应的酸,以保护机体免受醛类物质的毒害。在类胡萝卜代谢途径中,视黄醛脱氢酶(RALDH)是催化视黄醛不可逆氧化合成视黄酸的关键酶。昆虫ALDH基因家族的功能仅果蝇中有少许研究报道,尤其是其是否参与视黄酸信号途径未见研究报道。为验证家蚕ALDH基因家族在类胡萝卜素代谢途径中的功能,本研究首先对家蚕基因组中的ALDH同源基因进行了分析、鉴定Belumosudil供应商和分类,然后选取RALDH同源基因BmALDH1A1、BmALDH1A2、BmALDH1A3和BmALDH1A4进行了表达模式的检测,进一步构建表达载体,通过诱导表达、蛋白纯化获得有活性的酶蛋白,对BmALDH1A2酶蛋白的酶促活性进行检测,并通过定点突变技术确定影响活性的关键氨基酸位点,最后在细胞水平检测了BmALDH1A2和BmALDH1A4蛋白的亚细胞定位情况。主要研究结果如下:1.家蚕ALDH同源基因的鉴定及分析通过生物信息学分析在家蚕基因组中共鉴定出12个ALDH同源基因,预测编码18种蛋白质,均含有醛脱氢酶蛋白家族特有的Aldedh结构域。其中,与人类视Y-27632供应商黄醛脱氢酶RALDH同源的有四个基因,分别命名为BmALDH1A1、BmALDH1A2、BmALDH1A3和BmALDH1A4,均含有11个外显子。Medial plating四种RALDH同源蛋白的序列相似性达55%以上,且其二级结构和三级结构也非常相似。在后续的克隆测序中鉴定出BmALDH1A1基因存在8种不同的m RNA剪切形式,推测编码8种不同的蛋白质。2.家蚕RALDH同源基因(BmALDH1A1、BmALDH1A2和BmALDH1A4基因)的时空表达模式检测通过RT-PCR对家蚕RALDH同源基因在家蚕大造品系的时空表达模式进行了检测,结果显示,在家蚕的整个发育时期中BmALDH1A1基因的表达量均低于BmALDH1A2和BmALDH1A4基因的表达量。BmALDH1A1、BmALDH1A2和BmALDH1A4基因在胚胎期中的表达量均呈现先增加后降低的趋势;BmALDH1A1和BmALDH1A2基因在眠蚕中的表达量均低于对应起蚕中的表达量;BmALDH1A2基因在雌蛹、蛾中的表达量普遍高于雄蛹、蛾中的表达量,而BmALDH1A4基因的表达没有明显的雌雄差异。在家蚕五龄三天幼虫不同组织中,BmALDH1A1、BmALDH1A2和BmALDH1A4基因的表达情况各不相同,BmALDH1A1基因在体壁和精巢中有高量表达,BmALDH1A2基因在中肠中表达量最高,BmALDH1A4基因在精巢中表达量最高。综上所述,家蚕RALDH同源基因的表达存在组织和时期特异性。3.BmALDH1A2和BmALDH1A4蛋白的亚细胞免疫荧光定位利用制备的多克隆抗体研究家蚕BmALDH1A2和BmALDH1A4蛋白在家蚕卵巢细胞中的定位情况,结果显示,BmALDH1A2蛋白定位于线粒体中,而BmALDH1A4蛋白位于细胞质中。4.BmALDH1A2蛋白的酶活性研究通过酶活力实验将BmALDH1A2蛋白进行体外酶促反应的时间确定为30min,反应温度为30℃,最佳pH为7.5以及体系中包含的蛋白量确定为0.125 mg。对BmALDH1A2蛋白进行体外酶促反应后通过HPLC检测其反应产物,结果表明0.125 mg的BmALDH1A2蛋白可以在辅因子NAD~+存在的条件下将终浓度为10μM的全反式视黄醛(atRAL)完全转化为全反式视黄酸(atRA)。5.BmALDH1A2基因的定点突变与突变型BmALDH1A2蛋白的酶活性研究为了研究BmALDH1A2蛋白氨基酸序列的保守性,通过定点突变技术对在催化和辅酶结合中具有重要作用的三个氨基酸残基Glu182、Glu255和Cys289进行突变,并分别构建突变型BmALDH1A2表达载体,将其转化入BL21菌株中进行诱导表达和蛋白纯化,成功获得三种突变型BmALDH1A2蛋白,分别命名为BmALDH1A2~(E182S)、BmALDH1A2~(E255A)和BmALDH1A2~(C289S)。通过酶活力实验初步确定了突变型蛋白BmALDH1A2~(E182S)的酶活性与野生型蛋白BmALDH1A2基本一致,而突变型蛋白BmALDH1A2~(E255A)和BmALDH1A2~(C289S)完全丧失酶活性。对突变型BmALDH1A2蛋白进行体外酶促反应后通过HPLC检测其反应产物,结果再次表明突变型蛋白BmALDH1A2~(E255A)和BmALDH1A2~(C289S)功能完全丧失而突变型蛋白BmALDH1A2~(E182S)与野生型蛋白BmALDH1A2的功能一样,可以在辅因子NAD~+存在的条件下将atRAL转化为atRA。