猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以呕吐、腹泻、脱水为主要特征的一种高度接触性肠道传染病,给我国养猪业带来严重的经济损失。疫苗是防控PEDV的首选策略,但因病毒变异速度快、流行毒株多、疫苗研发滞后等问题,导致PED在我国猪群中频繁发生。因此,开展PEDV抗病毒药物等相关研究十分必要。金丝桃苷(hyperoside),广泛分布在多种植物果实及全草中,具有抗炎、抗菌和抗病毒等生物活性。本实验室前期研究发现金丝桃苷在体外通过拮抗PEDV N蛋白和p53蛋白相互作用,干预PEDV N蛋白介导宿主细胞S期阻滞抑制PEDV复制。山楂(Crataegus pinnatifida Bunge),富含金丝桃苷等物质,是一种“药食同源”植物,可作为提取金丝桃苷的理想来源。基于以上,本研究通过单因素、响应面试验明确山楂中金丝桃苷的最佳提取条件,并进一步通过体内外实验确证山楂中金丝桃苷抗PEDV作用及机制,为抗PEDV药物的开发提供理论依据。1.山楂中金丝桃苷的提取、纯化和鉴定为明确山楂中金丝桃苷的最佳提取条件,本研究采用单因素和响应面试验确定乙醇回流提取金丝桃苷的最佳条件为:乙醇浓度为70%,提取时间为120 min,固液比为1:19(g/m L),提取温度为81℃。在此条件下,山楂中金丝桃苷的提取率最大,为0.42 mg/g。采用大孔树脂HP-20、Sephadex-LH20凝胶柱纯化山楂中金丝桃苷粗提物,其纯度最终为98.79%。采用紫外光谱、红外光谱和质谱对纯化后的金丝桃苷提取物进行鉴定,紫外光谱结果显示,金丝桃苷提取物在250 nm和360 nm附近处出现与金丝桃苷标准品一致的特征吸收峰;红外光谱结果显示,金丝桃苷提取物在3 305、1 656、1 608、1 506、1 365、1 259和1 091 cm~(-1)处有与金丝桃苷标准品一致的吸收峰;质谱结果图显示,金丝桃苷提取物产生一个高纯度的分子离子峰m/z 462,该分子离子峰与金丝桃苷标准品一致。2.山楂中提取的金丝桃苷抗PEDV作用的研究为明确山楂中金丝桃苷抗PEDV作用,本研究通过细胞毒性测定、半数毒性浓度(CC_(50))测定,Western blot、TCID_(50)测定、半数有效浓度(EC_(50))测定等技术方法,分析金丝桃苷在Vero E6细胞上对PEDV复制的影响。结果显示,浓度为5.00μg/m L的山楂中金丝桃苷对Vero E6细胞无细胞毒性,山楂中金丝桃苷的CC_(50)为25.15μg/m L;与PEDV HM2017感染对照组相比,5.00μg/m L山楂中金丝桃苷能显著降低PEDV N蛋白表达(p<0.01);5.00μg/m L山楂中金丝桃苷处理组的PEDV HM2017病毒滴度为3.76 loVP-16纯度g_(10)TCID_(50)/m L,显著低于对照组的病毒滴度(4.79 log_(10)TCID_(50)/m L)(p<0.01);山楂中金丝桃苷的EC_(50)为2.59μg/m L,SI为9.71。为进一步明确山楂中金丝桃苷体内抗PEDV感染作用,本试验通过最佳给药剂量筛选和哺乳仔猪攻毒试验,评价山楂中金丝桃苷体内抗PEDV HM2017感染效果。结果显示,浓度低于500 mg/kg的山楂中金丝桃苷对小鼠存活率、体重、红细胞、白细胞和血小板等指标无影响。在攻毒48 h后,山楂中金丝桃苷组仔猪存活率为75%(3/4),PEDV感染对照组仔猪存活率为0%(0/4);与PEDV感染对照组仔猪相比,山楂中金丝桃苷可以减轻攻毒仔猪临床症状、肠道病理损伤;山楂中金丝桃苷组仔猪肛门拭子12 h、36 h的病毒载量分别为10~(6.58)copies/m L、10~(5.41)copies/m L,空肠和回肠病毒载量分别为10~(6.11)copies/g、10~(5.70)copies/g,显著低于PEDV感染对照组仔猪肛门拭子12 h(10~(7.48)copies/m L)、肛门拭子36 h(10~(7.12)copies/m L)、空肠(10~(7.44)copies/g)和回肠(10~(6.67)copies/g)病毒载量;显著抑制攻毒仔猪回肠中PEDV N蛋白的表达(p<0.05)。上述结果表明,山楂中金丝桃苷在体内外对PEDV具有抑制作用。3.山楂中提取的金丝桃苷抗PEDV作用机制的确证PEDV N蛋白与p53相互作用介导宿主细胞S期阻滞,进而促进病毒复制,金丝桃苷标准品能够拮抗PEDV N蛋白与p53相互作用,干预细胞S期阻滞进而抑制病毒复Tregs alloimmunization制。为确证山楂中金丝桃苷抗PEDV作用的机制,本研究通过体内外实验,采用Co-IP、Western blot等技术方法,分析山楂中金丝桃苷抗PEDV作用的机制。体外实验结果显示,在Vero E6细胞上,与PEDV感染对照组相比,5.00μg/m L山楂中金丝桃苷可以显著降低p53和p21蛋白表达(p<0.01),显著提高cyclin A蛋白表达(p<0.05),显著抑制PEDV N蛋白与p53相互作用(p<0.05)。体内实验结果显示,与PEDVCaptisol感染对照组仔猪相比,山楂中金丝桃苷显著抑制攻毒仔猪回肠中p53蛋白表达(p<0.05),显著抑制PEDV N蛋白与p53蛋白相互作用(p<0.05)。上述结果表明,山楂中金丝桃苷通过抑制PEDV N蛋白与p53相互作用,干预宿主细胞周期S期阻滞,进而发挥抗PEDV作用。综上所述,从山楂中成功提取到高纯度的金丝桃苷,山楂中提取的金丝桃苷通过抑制PEDV N和p53蛋白相互作用干预病毒介导宿主细胞周期阻滞在体内和体外发挥抗PEDV作用,为绿色廉价高效的抗PEDV天然药物开发奠定理论基础。