目的探讨蒙药蓝刺头对兔骨髓间充质干细胞(rabbit bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)体外增殖和成骨分化的影响;运用低温三维打印(three-dimensional printing,3D)技术联合冷冻干燥技术,复合聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)、纳米羟基磷灰石(nano hydroxyapatiten,nHA)、氧化石墨烯(graphene oxide,GO)制备骨组织工程支架,分析支架的理化性能及体外细胞相容性,评估其作为骨组织修复支架材料的可行性;以蓝刺头作为促成骨分化因素,初步探讨蓝刺头诱导种子细胞rBMSCs与PLGA/nHA/GO支架共培养复合体的体外成骨性能,以期为开发新型骨缺损修复支架提供参考;基于网络药理学及分子对接技术初步研究蓝刺头影响成骨分化的活性成分、作用靶点及可能机制,以期为后续药效物质和作用机制研究提供新的思路及参考依据。方法1.蒙药蓝刺头对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响制备蓝刺头冻干粉。采用CCK-8法检测不同浓度蓝刺头对rBMSCs增殖及活力的影响,并根据实验结果筛选培养基最适含药浓度进行后续实验。设置对照组为完全培养基培养、模型组为成骨诱导分化培养基培养、给药组为含0.01 mg/m L蓝刺头冻干粉的成骨诱导分化培养基培养。不同处理组分别连续干预rBMSCs 7 d、14 d后,采用偶氮法(para-nitrophenyl phosphate,pNPP)检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,BCIP/NBT法(5-bromo-4-chloro-3-inodlyl-phosphate,BCIP/Nitro-Blue-Tetrazolium,NBT)观察ALP染色情况;连续干预14 d、21 d后,采用茜素红染色法(alizarin red staining,ARS)观察基质矿化购买NVP-TNKS656情况并进行定量检测,实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测成骨分化相关指标Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(bone gla protein,BGLAP)、Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen,COL-I)及ALP mRNA的表达情况。2.3D打印骨组织工程支架的制备及其性能评价配置材料配比,设置PLGA组、PLGA/nHA组及PLGA/nHA/GO组,探索低温3D打印参数并联合冷冻干燥技术制备多孔支架。观察各组支架的大体形态,对支架宏观孔隙的孔径及孔隙率进行表征,通过扫描电镜观察支架微观形貌,运用机械试验机检测各组支架的力学性能,称重支架吸水前后质量并依据公式计算12 h内的吸水率,对各组支架降解过程中的质量变化、pH变化进行测定;将rBMSCs接种至各组支架,对支架的细胞黏附率、细胞毒性、细胞增殖情况进行检测。3.蒙药蓝刺头诱导兔骨髓间充质干细胞与3D打印支架体外共培养复合体的构建及成骨性能研究构建细胞-支架体外共培养复合体,设置A组为常规完全培养基培养的rBMSCs接种于PLGA/nHA/GO支架共培养,B组为成骨诱导分化培养基培养的rBMSCs接种于PLGA/nHA/GO支架共培养,C组为含0.01 mg/m L蓝刺头的成骨诱导分化培养基培养的rBMSCs接种于PLGA/nHA/GO支架共培养。各组分别共培养4 d、7 d后采用pNPP法检测ALP活性;共培养7 d后采用RT-qPCR法检测成骨分化相关基因ALP、RUNX2、OPN、COL-I及BGLAP的表达情况。4.基于网络药理学及分子对接探讨蒙药蓝刺头影响成骨分化的作用机制4.1基于网络药理学预测蒙药蓝刺头影响成骨分化的作用机制以CNKI、Pubmed等为主要数据库检索有关蒙药蓝刺头的所含化学成分,筛选其活性成分以及其相关靶点;运用Gene Cards及OMIM数据库筛选成骨分化相关靶点;通过Venn Diagram取交集得到蓝刺头活性成分与成骨分化相关的潜在作用靶点,利用Cytoscape构建药物-活性成分-交集靶点网络图;并运用Cluster Profiler对潜在作用靶点进行基因本体(gene ontology,GO)生物功能富集分析以及京都基因与基因组百科(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路富集分析;通过STRING数据库构建潜在作用靶点的蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,并利用Cytoscape筛选核心靶点。4.2基于分子对接技术验证蒙药蓝刺头影响成骨分化的机制依据4.1构建的PPI网络图,并通过MNC及EPC算法分别计算核心基因,与成骨分化相关信号通路基因取交集得交集基因。再结合上述分析得到的信号通路及互作蛋白,构建PPI-pathway网络,筛选出该网络中的共同相关基因。从GEO数据库中检索到成骨分化数据集,通过统计学t检验筛选出在成骨诱导分化前后出现显著差异表达的基因,作为分子对接的候选基因。运用Auto Dock进行分子对接验证筛选出的关键靶点与蓝刺头活性成分之间的结合情况。结果1.蒙药蓝刺头对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响CCK-8实验结果显示,与其余各组相比,浓度0.01 mg/m L蓝刺头组的吸光度值明显升高(P<0.05)。分别干预7 d、14 d后,与对照组比较,模型组及给药组均能够提高ALP活性水平(P<0.05),ALP染色着色深、范围大,且给药组比模型组效果更为明显(P<0.05),同时各组均存在一定时间依赖性(P<0.05);分别干预14 d、21 d后,与对照组比较,模型组及给药组ARS染色着色深、范围大,钙定量吸光度值大(P<0.05),均可上调成骨分化相关基因RUNX2、OPN、BGLAP、COL-I及ALP mRNA的相对表达量(P<0.05),且给药组比模型组效果更为明显(P<0.05),同时各组均存在一定时间依赖性(P<0.05)。2.3D打印骨组织工程支架的制备及其性能评价探索的打印参数适宜,成功制备成型的三维多孔PLGA、PLGA/nHA、PLGA/nHA/GO支架。PLGA及PLGA/nHA支架呈乳白色,加入GO后颜色略微偏灰;PLEnzyme InhibitorsGA支架外观挛缩较为严重,PLGA/nHA与PLGA/nHA/GO支架外观形态较为规整。俯视时支架宏观孔隙的孔径随着nHA和GO的加入而减小(P<0.05),PLGA组为(535±59)μm,PLGA/nHA组为(453±18)μm,PLGA/nHA/GO组为(343±24)μm;正视时各组支架孔径差异无统计学意义(P>0.05);三组支架孔隙率差异无统计学意义(P>0.05),均在70%左右。扫描电镜观察,三组支架表面均存在微观孔隙结构,PLGA组支架表面整体较平滑,微孔尺寸较小、深度较浅;PLGA/nHA及PLGA/nHA/GO组复合支架表面较粗糙,密集分布尺寸大小不一的大量微孔,其中添加GO的复合支架表面的凸凹形貌更为明显。力学测试结果显示,PLGA组支架的压缩模量最小(P<0.05),为(6.91±0.96)MPa;nHA的加入显著提高了复合支架的压缩模量,PLGA/nHA组支架的压缩模量为(9.13±1.27)MPa,PLGA/nHA/GO组支架为(8.93±1.27)MPa,两组差异无统计学意义(P>0.05)。24 h内吸水率测定结果显示,三组支架均表现为前6 h吸水率不断增加,6 h之后基本处于缓慢上升的平衡状态;12 h内PLGA/nHA/GO组支架吸水率最高(P<0.05)。支架的降解性能检测中,随着降解时间的延长,三组支架的质量损失率、降解速度均呈递增趋势;在降解2 w时三组支架的质量损失率及降解速度均较小(P>0.05),降解至检测结束的各时间点,PLGA组支架的质量损失率及降解速度均远大于另外两组复合支架(P<0.05),另外两组复合支架的质量损失率差异无统计学意义(P>0.05),PLGA/nHA/GO组支架的降解速度略大于PLGA/nHA组支架(P<0.05);随着降解时间的延长,三组支架降解液的pH基本均呈减小趋势,PLGA组支架的降解液逐渐降低至弱酸性,且pH值均远小于另外两组复合支架(P<0.05),PLGA/nHA组及PLGA/nHA/GO组复合支架的pH值在降解检测时间内稳定在7.1-7.4之间(P>0.05)。支架的生物相容性检测中,三组支架的细胞黏附率均随着接种时间的延长呈递增趋势,8 h时PLGA/nHA组及PLGA/nHA/GO组复合支架表现出较高的早期黏附能力(P<0.05),之后PLGA/nHA/GO组支架的细胞黏附率最高(P<0.05),PLGA组最低(P<0.05);细胞毒性检测结果显示,24 h时三组支架材料的浸提液对细胞相对增殖率无明显差别(P>0.05),细胞毒性分级均为0级;细胞增殖检测结果显示,随着培养时间的延长三组支架上的细胞均不断增殖(P<0.05),PLGA/nHA/GO组支架的OD值均远大于另外两组(P<0.05),PLGA组最低(P<0.05)。3.蒙药蓝刺头诱导兔骨髓间充质干细胞与3D打印支架体外共培养复合体的构建及成骨性能研究各组细胞-支架复合体分别共培养4 d、7 d后的ALP活性测定结果显示,仅使用完全培养基培养的A组也存在ALP活性表达;三组间的ALP活性表达差异均具有统计学意义(P<0.05),与完全培养基培养的A组相比,使用成骨诱导分化培养基的B组及C组ALP活性升高(P<0.05);与未添加蓝刺头的B组相比,添加蓝刺头的C组ALP活性水平提升;各对应组两时间点分别进行比较,ALP活性均有提升(P<0.05)。各组细胞-支架复合体共培养7 d后的RT-qPCR结果显示,与常规完全培养基培养的A组相比,使用成骨诱导分化培养基的B组及C组的各检测基因mRNA表达水平几乎均有不同程度增加(P<0.05);与未添加蓝刺头的B组相比,添加蓝刺头的C组的各检测基因mRNA表达水平提高,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.基于网络药理学及分子对接探讨蒙药蓝刺头影响成骨分化的作用机制4.1基于网络药理学预测蒙药蓝刺头影响成骨分化的作用机制筛选得到蓝刺头活性成分31个,蓝刺头活性成分靶点692个,成骨分化相关靶点1924个,蓝刺头活性成分成骨分化潜在作用靶点275个;GO生物学功能富集分析共得到2630个条目,包括2443个生物过程条目、51个细胞组分条目及136个分子功能条目,KEGG信号通路富集分析共得到164条信号通路。PPI网络显示8377对互作关系,筛选出度值排名LBH589 IC50前15位的关键靶点分别为TP53、AKT1、MYC、CTNNB1、TNF、JUN、STAT3、VEGFA、IL6、EGFR、CASP3、INS、SRC、IL1B、PTEN。4.2基于分子对接技术验证蒙药蓝刺头影响成骨分化的机制筛选得到分子对接候选基因IL6、PTEN;分子对接结果显示,关键靶点IL6与活性成分槲皮素及芹菜素、关键靶点PTEN与活性成分芹菜素之间具备相对较好的结合活性。结论1.蒙药蓝刺头具有能够促进体外培养条件下rBMSCs增殖及成骨分化的作用。2.运用低温3D打印技术联合冷冻干燥技术,配比PLGA、nHA、GO为原料,成功制备出三维多孔支架。其中,PLGA/nHA/GO复合支架具备更为优异的孔径与微观形貌,初始机械强度适宜,具有优异的吸水率及适宜的降解性能,且体外细胞相容性良好,具备进一步开发为骨组织工程支架材料的潜能。3.以蒙药蓝刺头作为促成骨分化因素,共培养rBMSCs-PLGA/nHA/GO支架复合体能够促进成骨分化,有望为骨组织工程领域骨再生修复提供新的思路。4.网络药理学证实蓝刺头通过多成分、多靶点、多通路发挥影响成骨分化作用,分子对接结果显示蓝刺头可能是通过活性成分槲皮素调控关键靶点IL6、芹菜素调控靶点IL6、PTEN而发挥影响成骨分化的作用。