马立克氏病(Marek’s Disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus,MDV)感染鸡引起的以严重免疫抑制和内脏肿瘤为主要特征的疾病。MDV的基因组大小约为177kb,由一个长独特序列(U_L)区和一个短独特序列区(U_S),以及位于U_L两端的反向重复序列区(TR_L和IR_L)以及U_S两端的反向重复序列区(TR_S和IR_S)组成。位于U_L和U_S区的基因与其他疱疹病毒(HSV-1,VZV)具有高度的同源性,然而大多数基因的功能仍然未知。其中,LORF9是MDV编码的独特基因,早期研究表明,LORF9缺失导致MDV特超强毒株致病性显著降低,但其参与致病的分子机制仍不清楚。为了进一步明确LORF9在MDV致病过程中的作用以及探索参与致病的分子机制,本研究以超强毒株Md5BAC为亲本毒株,利用细菌人工染色体技术(Bacterial artificial chromosome,BAC)平台,通过Red两步同源重组技术构建了LORF9基因缺失(Md5BAC△LORF9)和回复突变株(Md5BAC△LORF9-Re)。为了探究LORF9基因缺失毒株在体内的致病作用,将1日龄的SPF鸡随机分成4组,未接种病毒组为阴性对照组,另外3组SPF鸡颈部皮下分别接种2,000 PFU的Md5BAC、Md5BAC△LORF9和Md5BAC△LORF9-Re病毒。利用荧光定量PCR(q PCR)检测感染后5、7、14、60 d脾脏中的病毒拷贝数,发现Md5BAC△LORF9的复制拷贝数比Md5BAC和Md5BAC△LORF9-Re显著降低。在感染后第14 d,与阴性对照组相比,Md5BAC和Md5BAC△LOR点击此处F9-Re感染鸡胸腺和法氏囊发生显著萎缩,而Md5BAC△LORF9感染鸡没有显著变化。对所有试验组的SPF鸡进行60 d的致病性监测,发现阴性对照组未发病,Md5BAC△LORF9组发病率为23.8%,死亡率为14.2%,而Md5BAC和Md5BAC△LORF9-Re感染的SPF鸡发病率分别为63.0%和84.2%,死亡率分别为44.4%和84.2%。为了进一步研究LORF9缺失与免疫保护相关,将1日龄的SPF鸡随机分成4组,其中2组分别颈部皮下免疫接种500 PFU的Md5BAC△LORF9和CVI988/Rispens病毒,接种后第5 d对免疫组和另外1组进行Md5BAC攻毒,未攻毒组为阴性对照组。在攻毒后第14 d,Md5BAC感染组的平均体重显著降低,但Md5BAC△LORF9组的平均体重与阴性对照组相比没有显著差异。Md5BAC感染组引起显著的免疫器官萎缩;在Md5BAC△LORF9或CVI988/Rispens免疫组中的鸡中均未发生免疫器官萎缩。在60 d的致病性监测中,阴性对照组未发病,Md5BAC感染组SPF鸡发病率为85%,死亡率为80%,Md5BAC△LORF9和CVI988/Rispens免疫组中免疫保护率分别为94.4%和93.7%。以上结果表明:LORF9缺失后MDV毒株具有较强的免疫保护力。为了进一步探索LORF9参与MDV致病的分子机制,通过RACE实验分析表明LORF9仅有一个转录本且大小与预测的开放阅读框序列一致,表明基因内无内含子;Western blot和q PCR检skimmed milk powder测结果表明,LORF9的表达随着病毒体外CEF细胞增殖而增加;而在体内病毒感染早期表达水平较高。细胞亚定位和核质分离试验结果表明LORF9在细胞质和细胞核中均有表达。转录组测序结果表明Md5BAC△LORF9感染显著引起免疫基因的表达变化,但进一步研究发现LORF9可能不参与调控天然免疫反应中的I型干扰素信号通路;对LORF9蛋白进行表观遗传验证,表明LORF9不能被Us3进行磷酸化修饰,但LORF9是一个泛素化蛋白,可以发生K48和K63泛素化修饰,同时MDV USP能够抑制LORF9的泛素化。综上所述,本研究成功构建了Md5BAC△LORF9基因缺失毒株和Md5BAC△LORF9-Re回复毒株,证明LORF9基因缺失不影响MDV体外增殖,但显著降低病毒体内复制和致病性。LORF9基因编码一个selleckchem Puromycin转录本并在细胞质和细胞核均有表达,通过转录组测序表明LORF9缺失后会显著改变机体免疫相关基因的表达,但进一步研究表明LORF9可能不参与调控天然免疫反应中的I型干扰素信号通路,LORF9是可以被K48和K63修饰的泛素化蛋白,且MDV USP能够抑制LORF9的泛素化。本研究为阐明MDV致病分子机制提供理论基础,也为MDV基因缺失疫苗的研发提供新思路。