玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是一种广泛存在于食品和饲料中的真菌毒素,受污染的农畜产品中的ZEN能通过食物链对人体健康构成极大威胁,且目前尚无治疗ZEN中毒的特效药,因此,真菌毒素防控成为重要的研究热点之一。微生物脱毒具有转化效率高、反应条件温和、不影响饲料品质等优点,是解决真菌毒素问题的研究重点。解淀粉芽孢杆菌具有潜在降解真菌毒素能力,分泌多种胞外酶,促进动物肠道健康和生长性能,在食物、制药、农业等方面已得到广泛应用。实验室分离菌株解淀粉芽孢杆菌H6具有bioethical issues抑制禾谷镰刀菌生长,并合成硫酯酶高效降解玉米赤霉烯酮的功能。但同其他微生物相似,分离于自然界的原始菌株可能存在安全性,发酵水平低等问题,并且解淀粉芽孢杆菌H6能否减轻ZEN诱导的小鼠毒性损伤及其机制仍不清楚。本研究以解淀粉芽孢杆菌H6为试验菌株,评估了菌株安全性,优化了菌株的发酵条件,验证了菌株对饲料中ZEN及ZEN衍生物脱毒效果,对降解ZEN最适反应条件进行探究,在小鼠体内对降解ZEN效果进行应用评价。试验—:解淀粉芽孢杆菌H6体外安全性评价通过测定解淀粉芽孢杆菌H6的体外安全特性,表明解淀粉芽孢杆菌H6不携带毒力基因bceT、cytK、ces、hblA、nheA,不具有硝酸还原酶活性,不具有赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸脱羧酶活性,对青霉素G、氨苄西林、头孢唑林、阿米卡星、庆大霉素、红霉素、诺氟沙星、环丙沙星、复方新诺明、氯霉素10种抗生素均敏感,不具有溶血活性。经毒力基因检测,代谢产物毒性检测,耐药性检测,溶血性检测等,均具有安全性。试验二:响应面法优化解淀粉芽孢杆菌H6及其硫酯酶的发酵工艺以活菌数和芽孢量为指标,采用响应面分析方法,对解淀粉芽孢杆菌H6的培养基和发酵条件进行了优化,同时应用qPCR方法对硫酯酶基因mRNA表达水平和蛋白活性进行评估,并测定其对玉米赤霉烯酮降解活性。通过单因素试验筛选出培养基组成的最优碳源、氮源、无机盐分别为可溶性淀粉、酵母浸粉、MgSO4。Plackett-Burman试验结果表明可溶性淀粉浓度、酵母浸粉浓度、发酵时间是发酵的关键因素。Box-Behnken试验最终确定培养基和发酵工艺的最优参数为:可溶性淀粉:32.16 g/L,酵母浸粉:16.27 g/L,MgSO4:10.00 g/L,发酵时间:39.28 h,初始 pH 为 5.0,接种量为1%,转速为200 r/min,发酵温度为37℃。经摇瓶验证解淀粉芽孢杆菌H6菌体生物产量达到6.33×109 CFU/mL,50L发酵罐Bafilomycin A1价格验证菌体产量达到1.09×1010 CFU/mL。通过响应面优化了解淀粉芽孢杆菌H6的发酵工艺,与初始培养基相比发酵水平显著提高(P<0.05),硫酯酶活性显著升高(P<0.05),为解淀粉芽孢杆菌H6的工业化发酵奠定了基础。试验三:解淀粉芽孢杆菌H6对玉米赤霉烯酮及其衍生物降解情况探究通过解淀粉芽孢杆菌H6发酵霉变饲料进行脱毒,结果表明ZEN含量为436.74 μg/Kg的霉变饲料经解淀粉芽孢杆菌H6发酵脱毒处理后,ZEN毒素含量降低到81.53 μg/Kg。通过Autodock分子对接预测,结果表明ZEN衍生物:α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇和玉米赤霉酮配体分子与硫酯酶蛋白可以靶向结合,进一步生物降解验证,表明解淀粉芽孢杆菌H6对α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇有降解效果。硫酯酶降解ZEN最适反应温度为37℃,最适反应pH为6.0,添加Fe2+、Mg2+、Mn2+三种金属离子能够显著提高了硫酯酶酶活(P<0.05),提升了对ZEN降解速率。试验四:解淀粉芽孢杆菌H6体内降解玉米赤霉烯酮应用评价将48只SPF昆明小鼠分为4组(对照组、ZEN组、H6组、H6+ZEN组)灌胃28天,测定其体重,肝脏系数,血清生化指标(谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶),肝脏氧化指数指标(丙二醛、总超购买PLX3397氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化氢酶),通过HE染色分析小肠和肝脏组织病理变化,检测肝脏Nrf-2氧化应激信号通路(Nrf-2、HO-1、γ-GCS、GSH-Px)mRNA相对表达水平,并测定盲肠内容物微生物16S rRNA。结果表明,ZEN能够降低小鼠生长性能,诱导小鼠肝脏氧化损伤,改变肝脏和小肠形态结构,产生病理变化,造成盲肠微生物变化。解淀粉芽孢杆菌H6能缓解ZEN引起的小鼠体重降低,逆转ZEN引起的与氧化应激相关的血清生化指标、肝脏氧化指数指标、以及Nrf-2信号通路mRNA相对表达水平,拮抗小鼠肝脏中ZEN诱导的氧化损伤。与ZEN组相比,H6菌株减轻了肝脏和小肠的病理损伤,在盲肠微生物组成上,解淀粉芽孢杆菌H6重塑了盲肠菌群结构,在小鼠体内具有应用效果,能够拮抗ZEN诱导的小鼠肝脏和肠道损伤,调节肠道菌群结构。