熊去氧胆酸是临床上广泛使用的药物成分,作为胆汁酸它能溶解胆固醇结石,在治疗胆汁淤积性疾病时,改善肝功能。7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)作为酶法合成熊去氧胆酸的关键酶,可将C-7位点上酮羰基还原成β取向的羟基。但关于7β-HSDH的报道数量有限,工业上应用的来源仅有一两种,存在着很大的探索空间,同时,7β-HSDH的催化效率和稳定性偏低成为了生产熊去氧胆酸的限速环节。本研究通过异源表达获得了1种具有高转化率的7β-HSDH＿Osp,对其在催化生产熊去氧胆酸的工艺进行了优化,通过分子改造提高了其催化效率。主要研究内容如下:(1)在E.coli中高效异源表达1种来源于Olsenella sp.An188的具有高转化效率的7β-HSDH＿Osp。7β-HSDH＿ORegorafenib说明书sp的最适反应p H值为7.0(底物浓度为10 m M)、稳定p H范围为6.5-9.0、最适反应温度为55℃、热稳定性较高、催化常数k_(cat)值和表观二级速率常数k_(cat)/K_m值分别为558.72 min~(-1)和49.80 L·mol~(-1)·min~(-1)。(2)结合7α-羟基类固醇脱氢酶Perinatally HIV infected children,在“一锅法”催化鹅去氧胆酸生成熊去氧胆酸的最适条件下,转化效率达68.3%。共同表达7β-HSDH＿Osp和7α-HSDH＿Cd“一锅法”催化生产熊去氧胆酸时,全细胞催化显著高于游离酶催化的转化效率。采用高拷贝数的质粒p RSFDuet-1共表达7β-HSDH＿Osp和7α-HSDH＿Cd时,熊去氧胆酸的转化效率显著高于分别采用的质粒p RSFDuet-1和p ETDuet-1共表达,其转化率达68.0%。(3)基于辅因子循环再生的酶共表达“两步法”催化效率显著高于“一锅法”催化,游离酶7α-HSDH＿Es和乳酸脱氢酶LDH与7β-HSDH＿Osp和葡萄糖脱氢酶GDH循环再生系统催化具有较高转化效率(81.0%),且显著高于全细胞催化。采用基于辅因子循环再生系统单独表达酶催化时,熊去氧胆酸转化效率显著高于辅因子循环再生的共表达酶催化,转化效率达90.3%。基于上述优化方法,鹅去氧胆酸浓度为100 g·L~(-1)时,熊去氧胆酸转化率可达84.0%。(4)定点突变获得具有高催化效率的复合突变体T189V/V207MEPZ-6438 IC50,其k_(cat)/K_m值提高至7β-HSDH＿Osp的7.1倍。基于三级结构同源建模,确定了25个关键氨基酸残基位点,进行定点饱和突变,筛选获得5个具有高酶活力的突变体:T189V/V207M/V91P、T189V/V207M/M144H、T189V/V207M/G146A、T189V/V207M/A158S、T189V/V207M/V183I,其比酶活力分别提高至野生酶7β-HSDH＿Osp的3.5、3.6、3.6、3.5、3.8倍。其中,突变体T189V/V207M/G146A的k_(cat)/K_m值显著提高,由T189V/V207M的352.63 L·mol~(-1)·min~(-1)提高至654.42 L·mol~(-1)·min~(-1)。相较于T189V/V207M,酶突变体T189V/V207M/G146A与底物结合能降低,验证了其催化效率提高的结果。通过分析酶催化区域与底物之间的相互作用力,进一步解析了酶突变体催化效率提高的原因。基于优化后方法,突变体T189V/V207M/G146A在催化100 g/L底物时,转化率提高至91.2%。