目的结合网络药理学、分子对接技术和多公共数据库挖掘,并通过体内、体外的实验与验证,深入研究臭壳虫及其联合用药顺铂对肺腺癌的影响及其机制,以期为臭壳虫的临床药物研发提供理论依据。方法通过网络药理学方法和分子对接技术来分析臭壳虫抗非小细胞肺癌的分子靶点和作用机制。将20只Sprague-Dawley雄性大鼠按人与大鼠体表面积换算剂量灌胃臭壳虫汤剂,按照血清药理学方法制备臭壳虫含药血清,通过CCK-8实验、细胞划痕、Transwell小室实验、蛋白免疫印迹(Western blot)实验等体内细胞实验来研究臭壳虫及其联合用药顺铂对非小细胞肺癌A549细胞生长增殖、迁移和侵袭的影响。本实验采用C57BL/6小鼠皮下成瘤模型,将48只C57BL/6 Lewis非小细胞肺癌小鼠按平均瘤体随机分为4组(n=12),分别是:模型对照组、臭壳虫组、顺铂组和联合用药(臭壳虫+顺铂)组,连续用药14天,记录C57BL/6非小细胞肺癌小鼠的体质量、肿瘤的长径和短径,观察并记录C57BL/6非小细胞肺癌小鼠体质量的变化及其肿瘤生长情况;治疗结束后,取材称重肿瘤组织、脾脏及胸腺器官,计算实体瘤的生长抑制率、免疫器官指数;各组肿瘤组织行HE染色和IHC染色,观察各组肿瘤的组织形态及各组目的蛋白的阳性表达情况。通过网络药理学及分子对接,分析臭壳虫抗肺腺癌的分子作用机制;通过TCGA、GTEx等公共数据库,分析臭壳虫对肺腺癌差异预后的影响;通过NCBI、Gene Cards和KEGG等公共数据库,分析臭壳虫抗肺腺癌及其增强化疗药顺铂敏感性的铁死亡机制。结果(1)通过网络药理学分析得到臭壳抗非小细胞肺癌的潜在核心靶点有11个:ALB、HSP90AA1、SRC、CASP3、MAPK1、AR、CDC42、PGR、NOS3、CTSB、GSTP1。基因本体(GO)富集分析结果显示:生物过程主要与参与血管内皮生长因子受体信号通路、吞噬作用的Fcγ受体信号Gefitinib-based PROTAC 3使用方法通路、外源性凋亡信号通路的负调控等生物过程相关;细胞组分主要涉及胞浆、质膜、膜小凹、蛋白质复合体、核、外泌体、细胞质;分子功能主要涉及蛋白质结合、Rho-GDP解离抑制剂结合、相同蛋白质结合、丝裂原活化蛋白激酶结合、酶结合(P均<0.05)。基因组百科全书(KEGG)富集分析发现与非小细胞肺癌相关的条目有:VEGF信号通路、Estrogen信号通路、Adheren Junction信号通路、Rap1信号通路和MAPK信号通路等(P均<0.05)。分子对接结果显示各核心成分与潜在核心靶点之间具有较好的结合活性。(2)体外细胞实验方面,CCK-8实验结果显示,与空白对照组比较,臭壳虫含药血清组、顺铂组和联合用药组细胞增殖降低明显;与顺铂组比较,联合用药组细胞增殖降低明显(P均<0.05)。迁移侵袭实验结果显示,与空白对照组比较,臭壳虫含药血清组、顺铂组及联合用药组细胞划痕愈合面积、细胞迁移侵袭个数均减小;与顺铂组比较,联合用药组细胞划痕愈合面积、细胞迁移侵袭个数均减小(P均<0.05)。Western blot结果显示,与空白对照组相比,臭壳虫含药血清组、顺铂组及联合用药组中VEGF、SRC、CDC42和Bcl-2蛋白表达下调,CASP3和Bax的蛋白表达增加(P均<0.05)。(3)体内动物实验方面,在体质量变化上,臭壳虫组与模型对照组相比较无显著性差异(P>0.05);与模型对照组和臭壳虫组比较,顺铂组以及联合用药组小鼠体质量下降(P均<0.05)。在肿瘤生长上,模型对照组小鼠皮下瘤生长最快,联合用药组皮下瘤生长最慢。在免疫器官指数上,与模型对照组比较,臭壳虫组、顺铂组和联合用药组的免疫器官指数均下降(P均<0.05)。在肿瘤生长抑制率上,与模型对照组比较,臭壳虫组、顺铂组和联合用药组的瘤重均下降,抑瘤率均高于模型对照组;与顺铂组比较,联合用药组的瘤重减轻,抑瘤率高于顺铂组(P均<0.05)。肿瘤组织苏木精-伊红(HE)染色结果显示,模型对照组的肿瘤细胞核大圆,核质比高,各治疗组肿瘤细胞较多出现胞核behavioral immune system固缩深染或碎裂、边缘化、空泡化病理性核分裂明显减少。肿瘤组织免疫组化(IHC)染色结果显示,与模型对照组比较,臭壳虫组、顺铂组及联合用药组中VEGF、SRC、CDC42、Bcl-2蛋白阳性表达高,CASP3和Bax蛋白阳性表达低。(4)通过网络药理学分析得到臭壳虫治疗肺腺癌的潜在核心靶点有13个:SPHK1、PDGFRB、CXCR4、MAPK1、CCNE1、NFE2L2、CDK5、HIF1A、GSK3B、PTGS2、MMP9、CDK1、STAT1。基因本体富集分析结果显示:生物过程主要与平滑肌细胞增殖的正调控、蛋白质进入细胞核的正调节、凋亡过程的负调控、细胞迁移的正调节、蛋白质磷酸化、肽酰丝氨酸磷酸化和肽基苏氨酸磷酸化等生物过程相关;细胞组分主要涉及中心体、核质、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、细胞核和细胞质等细胞组分;分子功能主要涉及激酶活性、蛋白质结合、ATP结合、酶结合、p53结合等分子功能(P均<0.05)。基因组百科全书富集分析发现与肺腺癌相关的条目有:癌症通路、micro RNA癌症通路、IL-17信号通路、趋化因子信号通路、PI3K-Akt信号通路、VEGF信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性等(P均<0.05)。分子对接结果显示各核心成分与潜在核心靶点之间具有较好的结合活性。(5)臭壳虫治疗肺腺癌的潜在核心靶点CCNE1、CDK1、MMPProteases抑制剂9、STAT1、SPHK1、PDGFRB在肺腺癌瘤组织和正常组织间的表达差异具有统计学意义(P均<0.05),CCNE1、CDK1、PTGS2、GSK3B、CXCR4、HIF1A、SPHK1对肺腺癌总生存期的影响有统计学差异(P均<0.05)。臭壳虫治疗肺腺癌的潜在核心靶点SPHK1、PDGFRB、MAPK1、NFE2L2、HIF1A、GSK3B、PTGS2与铁死亡相关。结论(1)臭壳虫能够作用于VEGF、SRC、CDC42、CASP3、Bcl-2和Bax等靶点,调控VEGF信号通路,抑制人肺腺癌A549细胞的生长增殖、迁移和侵袭,抑制小鼠肺腺癌Lewis细胞的增殖;(2)臭壳虫可能作用于SPHK1、PDGFRB、CXCR4、MAPK1、CCNE1、NFE2L2、CDK5、HIF1A、GSK3B、PTGS2、MMP9、CDK1、STAT1等靶点发挥抗肺腺癌的作用;(3)臭壳虫可能作用于CCNE1、CDK1、SPHK1等靶点影响肺腺癌患者的生存预后;(4)臭壳虫可能通过铁死亡作用于SPHK1、PDGFRB、MAPK1、NFE2L2、HIF1A、GSK3B、PTGS2等铁死亡相关基因增强化疗药顺铂的敏感性。