目的:本课题组在前期数据分析中发现CEBPA双突变患者中2例患者存在ELF4D124T*21突变,2例患者存在ELF4R234*突变。本研究通过分子水平、蛋白质水平以及细胞水平进一步探索ELF4突变对白血病细胞的影响以及ELF4在CEBPA突变急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)中的作用及其机制。方法:构建野生型及突变型ELF4和CEBPA的表达载体,使用转盘式激光共聚焦观察与绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Proteins,GFP)融合表达的野生型及突变型ELF4、与红色荧光蛋白(Red Fluorescent Proteins,RFP)融合表达的野生型及突变型CEBPA在细胞内的定位。通过双荧光素酶报告基因系统检测野生型及突变型ELF4或CEBPA对下游靶基因的转录激活作用。利用dox诱导的慢病毒载体系统构建可诱导表达野生型及突变型ELF4、CEBPA的白血病细胞系,研究其对白血病细胞增殖的影响。应用CRISPR/Cas9的方法敲除白血病细胞系ELF4、CEBPA基因并观察白血病细胞增殖的变化。通过免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)实验探究CEBPA与ELF4蛋白质在细胞内是否结合。结果:1.探究突变型 ELF4(ELF4D124T*21、ELF4R234*)的功能。在细胞内定位方面,与GFP融合表达的野生型ELF4和ELF4R234*与蓝色细胞核重叠提示其定位于细胞核中,与GFP融合表达的ELF4D124T*21与蓝色细胞核完全不重叠,提示其定位在细胞浆中。在转录活性方面,野生型ELF4对下游靶基因报告质粒的平均激活作用是阴性对照组的11.65倍(P<0.001),是ELF4D124T*21的9.87倍(P<0.001),是ELF4R234*的 12.07倍(P<0.001),且ELF4D124T*21、ELF4R234*与阴性对照组激活作用无差异(P>0.05)。在细胞增殖方面,Molm13细胞系中,dox诱导野生型或突变型ELF4表达72h时,表达突变型ELF4D124T*21、ELF4R234*的细胞增长为0h的5.56倍和5.8倍,与表达空载体的阴性对照组细胞增长倍数(6.03倍)相仿,而表达野生型ELF4的细胞增长倍数为1.47倍明显少于阴性对照组和表达突变型ELF4组(P<0.001),在其他白血病细胞系(K562细胞系、U937细胞系)中也得到了相似的结果。2.探究ELF4与CEBPA是否存在相互影响。在分子水平,一方面,野生型CEBPA对其下游靶基因(G-CSFR)报告质粒的激活作用是阴性对照组的29.57倍,野生型ELF4和野生型CEBPA同时加入后激活倍数升至44.36倍,两者联合时明显高于单独的野生型CEBPA(P<0.01),提示野生型ELF4可以明显增强野生型CEBPA对下游靶基因报告质粒的转录激活作用;另一方面,野生型ELF4对其下游靶基因(IL-3)报告质粒的激活作用是阴性对照的8.97倍,当在此体系中同时加入野生型CEBPA和野生型ELF4后激活倍数降至4.54倍,转录激活作用明显低于单独野生型ELF4(P<0.05),提示野生型CEBPA可以减弱野生型ELF4对下游靶基因报告质粒的激活作用。在蛋白质水平,与RFP融合表达的野生型CEBPA和与GFP融合表达的野生型ELF4可重叠呈现黄色,提示二者存在共定位;免疫共沉淀(CO-IP)结果显示带有Flag标签的ELF4在以Flag作为CO-IP抗体时可以下拉野生型CEBPA,提示CEBPA与ELF4在细胞中存在相互结合。在细胞水平,敲除Molm13细胞系的CEBPA和ELF4后检测72h细胞增殖,我们发现两个基因都没有敲除的阴性对照组(NC-RFP+NC-Puro组)细胞增长为0h的3.06倍,仅敲除CEBPA组(CEBPAsg3+NC-puro:1.82倍)细胞增殖明显慢于阴性对照组(P<0.0001),而敲除CEBPA和ELF4组的细胞增长倍数(CEBPAsg3+ELF4sg3:2.93 倍、CEBPAsg3+ELF4sg5:2.87 倍)明显快于敲除 CEBPA组(P<0.0001)。我们用CEBPAsg8重复上述实验也得到了相似的结果,结果提示敲除ELF4能够部分解除敲除CEBPA对Molm13细胞系的抑制增殖作用。结论:本研究从细胞内定位、转录活性、细胞增殖等方面证明了白血病细胞中ELF4突变(ELF4D124T*21、ELF4R234*)是功能缺失的突变。另外,通过分子水平、蛋白质水平和细胞水平证明了 ELF4与CEBPA在白血病细胞中存在相互作用,为ELF4在CEBPA突变的AML发病机制的研究提供了线索。目的:回顾性分析239例新诊断的CEBPA双突变(double-mutated CEBPA,CEBPAdm)急性髓系白血病(AcCH-223191体外ute myeloid leukemia,AML)(非APL)患者的临床特征,并比较不同突变类型的CEBPAdm患者的基线特征和转归。方法:收集本中心于2011年7月至2021年12月新诊断的2211例AML(非APL)中239例符合纳入标准的CEBPAdm患者的临床资料及生存情况。根据是否含有bZIP 区域的突变,将其分为CEBPAdmnonbZIP组和CEBPAdmbZIP组。对这两组患者进行临床特征以及转归的比较分析。使用SPSS(21.0)软件对数据进行分析,GraphPad Prism(7.0)软件作图。结果:1.239例CEBPAdm AML患者中位年龄为40岁(IQR 30-48岁),中位随访时间为 42.43 个月(IQR 19.57-60.57 个月)。中位生存期(Overall survival,OS)和无事件生存期(Event-free survival,EFS)分别为 33.53 个月(IQR 17.20-59.13 个月)和 23.70 个月(IQR10.30-56.00 个月)。2.CEBPAdmbZIP组和CEBPAdmnonbZIP组患者的基线特征比较:CEBPAdmnonbZIP 组患者 GATA2 突变率为 0%,CEBPAdm bZIP 组为 30.29%,(P=0.034)。在治疗方面,两组诱导化疗后CR率及MRD阳性率没有统计学差异(P=1.000)。3.CEBPAdmbZIP组和CEBPAdmnonbZIP组患者的转归比较:OS与EFS均无统计学差异(OS:HR=2.027,95%CI 0.802-5.121,P=0.135;EFS:HR= 1.147,95%CI 0.501-2.626,P=0.746)。当 CR1-HSCT 视为删失事件时,CEBPAdmnonbZIP 组患者 OS 为 16.63 个月(IQR7.67-34.87 个月),CEBPAdmbZIP 组患者 OS 为 27.27 个月(IQR11addiction medicine.08-56.97 个月)(HR=3.132,95%CI 1.223-7.979,P=0.017),EFS 没有统计学差异(HR=1.437,95%CI 0.627-3.293,P=0.391)。R/RAML 患者中CEBPAdmnonbZIP 组患者 OS 为 22.93 个月(IQR7.67-23.13 个月),CEBPAdmbZIP组患者 OS 为 25.55 个月(IQR16.95-40.87 个月)(HR=2.881,95%CI 1.021-8selleckchem Barasertib.131,P=0.046)。结论:CEBPAdm患者预后良好。CEBPAdmnonbZIP组患者GATA2突变发生率低,当CR1-HSCT被认为是删失事件时,CEBPAdmnonbZIP患者OS较短,但病例数有限,未来需要扩大样本量后进一步验证。