目的:肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC,以下简称肝癌)是全球癌症死亡的第三大原因,每年给人们带来巨大痛苦和损失。目前,肝癌的治疗方式主要是手术结合放化疗,然而目前的治疗措施下患者五年生存率仍然较低。肝癌的发展和转归是肝癌Affinity biosensors细胞与机体免疫相互作用的结果。大多数肝癌患者存在免疫耐受,以及基础肝病引起的慢性炎症,进一步增强了免疫逃逸,使癌细胞得以生长。CD8~+T淋巴细胞是抗肿瘤免疫的主要介质,调节CD8~+T细胞的反应一直是癌症免疫治疗的焦点。当CD8~+T细胞特异性识别主要组织相容性复合体分子(Major Histocompatibility Complex,MHC)呈现的抗原肽时,它们能被激活并杀死肿瘤细胞。事实上,研究表明肿瘤已经发展出各种方法来限制抗原的识别从而造成免疫逃逸,因此探讨肿瘤免疫逃逸的分子机制对肿瘤免疫治疗的相关策略有着重要的指导作用。癌症是一种疾病的集合,其特征是由基因突变引起的细胞生长异常和失控。约50%的肿瘤中存在p53突变,在肝癌中约有30%左右的患者发生p53突变。近年研究发现,p53突变参与了肿瘤免疫微环境的重塑,成为肿瘤发生的免疫驱动因素。因此本课题旨在明确p53突变在肝癌中的临床意义,并深入探讨p53突变与肝癌免疫逃逸的相关性,以及p53突变调控肝癌细胞免疫逃逸的具体机制,为肝癌的发生、发展过程以及治疗提供理论基础。研究方法:1.实验材料:人肝癌细胞系Hep3B和PLC/PRF/5、小鼠肝癌细胞系Hepa1-6、C57BL/6小鼠、OT-Ⅰ小鼠和NOD-SCID免疫缺陷小鼠。2.实验方法:(1)生物信息学分析:从TCGA获取肝细胞癌临床数据、表达数据以及突变数据,表型信息按照p53突变以及野生进行分组,提取265例肝癌患者临床病例资料用于后续统计分析。基于R环境使用Limma包进行差异基因分析,使用GSEA软件进行富集分析。(2)细胞培养:培养人肝癌Hep3B和PLC/PRF/5细胞系。(3)病毒转染:利用慢病毒表达系统技术分别在Hep3B细胞系中转染PLVX作为对照组,转染过表达p53R249S作为实验组;在PLC细胞系中转染PLKO作为对照组,转染shp53即p53敲除作为实验组。构建稳定过表达p53R249S突变的Hepa1-6小鼠肝癌细胞及过表达OVA的Hepa1-6-p53R249S细胞。(4)MTT实验:检测肝癌细胞的增殖能力。(5)克隆形成实验:检测肝癌细胞的克隆集落形成能力。(6)细胞划痕实验:检测肝癌细胞迁移能力。(7)小鼠皮下成瘤实验:利用稳定过表达p53R249S突变的Hepa1-6小鼠肝癌细胞及过表达OVA的Hepa1-6-p53R249S细胞进行皮下成瘤,检测肿瘤大小、重量和体积。(8)小鼠肿瘤组织淋巴细胞提取:利用肿瘤组织消化液和密度离心法提取小鼠皮下瘤体中的淋巴细胞。(9)人外周血CD8~+T细胞提取:取健康志愿者静脉血应用人淋巴细胞分离液收集外周血单个核细胞,随后利用磁珠分选和体外激活剂刺激得到CD8~+T细胞。(10)细胞共培养实验:将病毒转染后的人肝癌细胞与CD8~+T细胞共培养,用于后续流式分析;OT-Ⅰ小鼠CD8~+T细胞与Hepa1-6-OVA-p53R249S小鼠肝癌细胞共培养用于后续LDH杀伤实验。(11)流式细胞术:检测小鼠皮下瘤体中的T淋巴细胞浸润情况以及瘤体CD8~+T淋巴细胞中颗粒酶B、穿孔素STM2457化学结构水平;检测小鼠皮下瘤体中H2K的表达;检测肝癌细胞表面与胞内MHC-Ⅰ的表达;检测细胞共培养后CD8~+T数量及CD8~+T中颗粒酶B、穿孔素水平。(12)LDH杀伤实验:计算CD8~+T细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。(13)免疫组化:检测小鼠皮下瘤体组织中CD8及H2K的蛋白表达水平。(14)免疫荧光:用于检测MHC-Ⅰ与LC3在细胞中共定位情况。(15)实时荧光定量PCR:检测肝癌细胞中TAP1、TAP2、ERAP1、ERAP2、β2m、MHC-Ⅰ的m RNA水平;检测小鼠皮下瘤体组织中p53和H2K的m RNA水平。(16)蛋白质印迹实验:检测肝癌细胞中TAP1、TAP2、ERAP1、ERAP2、β2m、MHC-Ⅰ、LC3、p62、CDKN2A、BIRC5和SPHK1的蛋白水平;检测小鼠皮下瘤体组织中p53和H2K的蛋白水平。(17)透射电镜:用于观测自噬小体情况。(18)统计学分析:本实验所有数据使用软件SPSS 22.0完成统计,所有数据使用均数±标准差的形式进行展示,并且所有实验均完成三次独立重复实验。同时,本实验中的柱状图量化及折线图由Prism 9(Graph Pad Software)完成。正态分布资料两样本比较时采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。当P<0.05时,认为该数据具备统计学差异。3.实验方案:3.1肝癌细胞及组织中p53突变的临床意义(1)评估肝癌组织中p53突变情况,基于R4.1.2环境,对TCGA数据库中肝癌组织样本数据进行基因突变分析:对肝癌患者p53突变情况、p53突变的肝癌患者总生存期以及p53突变与临床病理特征的关系进行比较分析,明确肝癌组织中p53突变的临床意义。(2)应用慢病毒表达系统技术分别在Hep3B细胞系中转染PLVX作为对照组,转染过表达p53R249S作为实验组;在PLC细胞系中转染PLKO作为对照组,转染shp53即p53敲除作为实验组。随后通过MTT增殖实验、平板克隆形成、细胞划痕实验等评估肝癌细胞中p53突变对于肝癌细胞恶性行为的影响,明确肝癌细胞中p53突变的临床意义。(3)利用重度免疫缺陷小鼠模型判断p53R249S突变对无免疫功能小鼠中的皮下成瘤效果,构建了稳定过表达p53R249S突变的Hepa1-6小鼠肝癌细胞。将1×10~6的Hepa1-6-PLVX细胞作为对照组以及Hepa1-6-p53R249S细胞作为实验组接种于小鼠皮下,在出现可见瘤体后每间隔2天记录瘤体生长情况。瘤体生长第21天后将小鼠脱颈处死并取出皮下瘤拍照称重。3.2 p53R249S突变导致CD8~+T细胞免疫杀伤能力减弱(1)评估肝癌组织中p53突变与肿瘤免疫相关通路的相关性,从TCGA获取肝细胞癌临床数据、表达数据以及突变数据,从突变数据获取p53突变情况,筛选肿瘤组织,肿瘤样本按照p53突变以及野生型进行分组,基于R环境使用Limma包进行差异基因分析,使用GSEA软件进行免疫相关通路基因进行功能富集分析。(2)评估p53R249S突变对免疫细胞浸润的影响,将1×10~6的Hepa1-6-PLVX细胞以及Hepa1-6-p53R249S细胞接种于C57BL/6小鼠皮下。成瘤后第21天从瘤体组织中提取了淋巴细胞,利用流式细胞术分析瘤体里的CD45~+、CD3~+、CD8~+等免疫细胞浸润情况。(3)小鼠成瘤实验方法同上,利用体内中和抗体与免疫组化实验判断p53R249S突变促进瘤体生长依赖于CD8~+T细胞。(4)利用流式细胞术检测Hepa1-6-p53R249S小鼠皮下瘤体中CD8~+T细胞中的杀伤因子穿孔素与颗粒酶的表达情况。(5)利用磁珠分选技术提取CD8~+T细胞并刺激其分化成为成熟的T细胞后,与上述构建的人肝癌细胞系(p53R249S突变型肝癌细胞与p53空载的肝癌细胞相互对比)共培养,流式细胞术和LDH杀伤实验检测CD8~+T细胞的功能,判断p53R249S突变是否调控CD8~+T细胞的免疫杀伤功能。(6)采用OT-Ⅰ小鼠模型并构建了表达OVA的Hepa1-6-p53R249S细胞,探究p53R249S突变是否影响CD8~+T细胞介导的针对肿瘤细胞表面OVA特异性小肽的免疫应答;利用流式细胞术、免疫组化、LDH杀伤实验等验证p53R249S突变是否调控特异性抗原加工-提呈作用从而造成免疫识别杀伤减弱。3.3 p53R249S突变通过自噬途径影响免疫杀伤功能:(1)评估p53R249S突变导致免疫杀伤能力减弱的具体原因,p53R249S突变型肝癌细胞与p53空载的肝癌细胞相互对比,采用PCR、western blot、流式细胞术、免疫荧光等实验分析抗原提呈关键分子MHC-Ⅰ的分布与表达,探究p53R249S突变导致免疫识别过程受损的机制。(2)探究p53R249S突变影响MHC-Ⅰ表达的具体原因,通过western blot、免疫荧光共聚焦、流式细胞术明确p53R249S突变影响MHC-Ⅰ降解的机制。(3)评估自噬是否参与p53R249S突变介导的免疫杀伤功能减弱,利用流式细胞术、免疫组化、透射电镜、LDH杀伤实验以及自噬抑制剂氯喹明确p53R249S突变通过自噬途径影响MHC-Ⅰ造成免疫逃逸。(4)小鼠皮下成瘤实验探究抑制自噬对p53R249S突变介导的Torin 1说明书瘤体生长的影响。(5)利用R语言、western blot和PCR实验探究可能参与p53R249S突变调控自噬的关键基因。(6)利用流式细胞术检测应用氯喹后小鼠皮下成瘤中的CD8~+T细胞浸润情况及颗粒酶B和穿孔素表达情况,探究阻断自噬后能否逆转p53R249S突变导致CD8~+T细胞免疫杀伤功能失调。(7)采用OT-Ⅰ小鼠模型及流式细胞术、免疫组化、LDH杀伤实验等验证p53R249S突变是否通过自噬途径影响MHC-I类分子的特异性抗原加工-提呈作用从而造成免疫杀伤能力减弱。结果:第一部分:p53突变的肝癌细胞逃避了免疫监视导致不良预后生物信息学分析:1.肝癌患者中最常见的基因是p53突变(30%),p53R249S突变是肝癌患者中最常见的p53突变;2.p53突变肝癌患者比p53野生型的肝癌患者的总生存期和无病生存期显著缩短(P<0.005);3.p53突变与TNM分期,分化程度,门静脉浸润以及淋巴结转移都密切相关。体外细胞学实验:1.p53R249S突变促进肝癌细胞的增殖活力;2.p53R249S突变促进肝癌细胞生长出更多的克隆团落;3.p53R249S突变促进了肝癌细胞的迁移能力。小鼠体内实验:1.p53R249S突变的小鼠瘤体的体积和重量明显增加;2.p53R249S突变能够减弱无免疫功能小鼠中的成瘤效果。第二部分:p53R249S突变导致CD8~+T细胞免疫杀伤能力减弱生物信息学分析:GSEA分析发现肝癌组织中p53突变与抗原提呈、干扰素信号、TCR信号、细胞因子、先天免疫反应等免疫相关过程密切相关。小鼠体内实验:1.p53R249S突变导致的皮下瘤体中有更少的T淋巴细胞浸润,CD8~+T细胞占所有淋巴细胞比例明显下降;2.p53R249S突变促进瘤体生长依赖于CD8~+T细胞;3.p53R249S突变能够导致瘤体中CD8~+T细胞表达更少的颗粒酶B和穿孔素;4.p53R249S通过影响MHC-I类分子的特异性抗原加工-提呈作用从而造成免疫杀伤减弱。体外细胞学实验:1.p53R249S突变能够导致CD8~+T细胞的杀伤效率降低;2.p53R249S突变抑制CD8~+T细胞的免疫杀伤功能。第三部分:p53R249S突变通过自噬途径影响免疫杀伤功能体外细胞学实验:1.p53R249S突变没有改变MHC-Ⅰ的m RNA表达水平,但是能够导致MHC-Ⅰ的蛋白水平有所减弱(P<0.05);在正常肝细胞中MHC-Ⅰ蛋白均正常表达于细胞膜上和胞质中,而p53R249S突变的Hep3B细胞膜表面只表达较少的MHC-Ⅰ蛋白;2.p53R249S突变通过自噬途径导致MHC-Ⅰ降解增多。3.p53R249S突变促进自噬导致MHC-I类分子降解增多从而无法有效地提呈于膜表面。生物信息学分析:CDKN2A和SPHK1是p53R249S突变促进自噬的关键基因。小鼠体内实验:1.抑制自噬能够减弱p53R249S突变介导的瘤体的生长;2.抑制自噬恢复p53R249S突变介导的CD8~+T细胞功能失调;3.p53R249S突变是通过自噬途径影响MHC-I类分子的特异性抗原加工-提呈作用从而造成免疫杀伤能力减弱。结论:1.p53R249S突变是肝癌患者中最常见的p53突变,p53R249S突变导致肝癌不良预后是因为发生了免疫逃逸。2.p53R249S突变通过影响MHC-I类分子的特异性抗原提呈作用造成了免疫杀伤功能减弱。3.p53R249S突变通过自噬途径降解MHC-Ⅰ类分子促进免疫逃逸。