研究背景脓毒症相关性脑损伤是继发于脓毒症或脓毒症休克最主要的并发症之一。大脑是脓毒症病程早期最易受累的靶器官,甚至患者神经系统症状的出现远远早于休克。即使脓毒症及脓毒症休克已纠正,脓毒症相关性脑损伤仍可遗留长期神经功能损伤或运动功能障碍。脓毒症相关性脑损伤通常是一种无菌性神经炎症,可引起神经元损伤或脑功能障碍。机体在应对炎症反应的过程中,生成大量高度不稳定的氧自由基,进一步导致脂质过氧化,进而产生过多的内源性活性醛,最终造成脏器功能损伤。乙醛脱氢酶2(Acetaldehydehydrogenase2,ALDH2)是一种主要的醛代谢酶,除主要在肝脏进行乙醇代谢外,在脑组织中也有较为广泛的分布。因此,我们认为积极探索ALDH2在脓毒症相关性脑损伤中的作用及机制,对于优化脓毒症相关性脑损伤的诊疗及改善患者生活质量及预后存在重要意义。研究发现,通过盲肠结扎穿孔(Cecal ligation and perforation,CLP)手术建立动物脓毒症模型后,可以观察到靶器官ALDH2活性降低,而ALDH2的磷酸化对脓毒症起到保护作用。此外,既往研究证实ALDH2在多种神经系统疾病过程中保护神经功能,然而,少有研究评估ALDH2在脓毒症相关性脑损伤过程中的作用及其潜在的机制。研究目的对脓毒症相关性脑损伤过程中ALDH2的潜在作用和可能的分子机制进行研究。研究方法第一部分采用CLP手术建立脓毒症动物模型。24只雄性SD大鼠随机分成假手术组(n=6)、CLP组(n=6)、CLP+氰胺(Cyanamide,CYA)组(n=6)和CLP+Alda-1组(n=6)。全程监测大鼠的生命体征,分别在CLP基础点(Baseline,BL)、术后3h、术后6h及术后12h完善动脉血气分析,CLP术后6h及12h取海马组织行病理染色及ALDH2活性分析。Western blot和酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分别用于检测NOD样受体家族含PYRIN结构域蛋白3(NOD-like receptors family pyrin domain containing protein 3,NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated-speck likeprotein,ASC)、焦孔素D(Gasdermin D,GSDMD)、白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)和白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的表达水平。第二部分以脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)处理的HT22细胞作为脓毒症相关性脑损伤的体外模型,分别以Alda-1或CYA预处理,进一步研究其潜在分子机制。Western blot和实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RTq PCR)分别检测NLRP3,caspase-1,GSDMD和ASC的蛋白和m RNA表达水平,ELISA检测IL-18和IL-1β表达水平。研究结果第一部分1.平均动脉压(Mean arterial pressure,MAP):与BL水平相比,4组大鼠的MAP呈现下降趋势。其中,CLP组、CLP+Alda-1组和CLP+CYA组的大鼠MAP在CLP术后3h,6h及12h均低于假手术组,且差异具有统计学意义,而CLP组、CLP+Alda-1组和CLP+CYA组3组之间的大鼠MAP值并没有明显统计学差异。2.动脉血气分析指标:与BL水平相比,4组大鼠的动脉血乳酸呈上升趋势。CLP术后6h,12h,CLP组、CLP+Alda-1组和CLP+CYA组的大鼠乳酸高于假手术组,差异有统计学意义;并且在CLP术后6h和12h,CLP+Alda-1组的大鼠乳酸低于CLP组,CLP+CYA组的大鼠乳酸高于CLP组,差异均具有统计学意义。4组大鼠的碱剩余(Base excess,BE)与BL水平相比呈下降趋势,在CLP术后3h,6h,12h,CLP组、CLP+Alda-1组和CLP+CYA组的大鼠BE均低于假手术组,差异均具有统计学意义,而CLP组、CLP+Alda-1组和CLP+CYA组3组大鼠的BE并没有明显统计学差异。4组大鼠的酸碱度在统计学上无明显差异。3.海马组织病理损伤评分及ALDH2活性:CLP术后12h,海马组织CA1区锥体细胞出现病理损伤,并可观察到ALDH2活性降低,差异均有统计学意义。CLP+Alda-1组大鼠的海马CA1区锥体细胞的病理损伤较CLP组大鼠好转,ALDH2活性也有所好转,差异均具有统计学意义。CLP+CYA组大鼠的海马CA1区锥体细胞的病理损伤较CLP组大鼠更为严重,ALDH2活性进一步降低,差异均具有统计学意义。4.海马组织NLRP3炎症小体和焦亡标志蛋白的表达:CLP术后6h,大鼠脑组织NLRP3,caspase-1,GSDMD和ASC蛋白表达水平下降低,CLP术后12h差异有统计学意义。CLP术后12h,CLP+Alda-1组大鼠脑组织NLRP3,caspase-1,GSDMD和ASC蛋白水平较CLP组表达减少,差异具有统计学意义。而CLP+CYA组的大鼠海马组织NLRP3,caspase-1,GSDMD和ASC的蛋白表达水平均高于CLP组,差异存在统计学意义。5.炎症因子水平:CLP术后6h和12h,大鼠IL-1β和IL-18水平升高,差异具有统计学意义。其中,CLP+Alda-1组的大鼠血清IL-1β,IL-18明显低于CLP组,CLP+CYA组的大鼠血清IL-1β,IL-18明显高于CLP组,差异均具有统计学意义。第二部分1.HT22细胞的存活率和ALDH2活性:LPS处理导致HT22细胞的存活率降低,并伴随ALDH2活性的降低,差异存在统计学意义。LPS+Alda-1组HT22细胞存活率和ALDH2活性高于LPS组,差异均具有统计学意义。LPS+CYA组HT22细胞存活率和ALDH2活性均明显低于LPS组,差异存在统计学意义。2.HT22细胞NLRP3炎症小体和焦亡标志蛋白的表达:经LPS处理后,HT22细胞的NLRP3,caspase-1,GSDMD和ASC蛋白及RNA表达水平均明显升高,差异具有统计学意义。LPS+Alda-1组HT22细胞NLRP3,caspase-1,GSDMD和ASC蛋白及RNA表达水平低于LPS组,且差异具有统计学意义。LPS+CYA组HT22细胞NLRP3,caspase-1,GSDMD和ASC蛋白及RNA表达水平高于LPS组,差异均具有统计学意义。3.炎症因子水平:与对照组相比,暴露于LPS的HT22细胞IL-1β,IL-18表达水平升高,差异具有统计学意义。LPS+Alda-1组与LPS组相比,HT22细胞IL-1β和ABT-199化学结构IL-18水平较低,差异具有统计学意义。LPS+CYA组HT22细胞IL-1β和IL-18水平比LPS组进一步升高,差异FUT-175浓度存在统计学意义。研究结论1.激活ALDH2可以改善脓毒症相关性脑损伤。2.这种保护作用的Biogeographic patterns潜在机制可能是通过调节NLRP3炎症小体活性及IL-1β和IL-18诱导的炎症反应,缓解海马细胞焦亡。3.ALDH2和NLRP3炎症小体、细胞焦亡或成脓毒症相关性脑损伤防治新靶点。