氟(Fluoride,F)是人体必PLX4032配制需微量元素之一,在日常生活和野外环境中十分常见,其主要通过呼吸、饮食、饮水等途径对机体造成损伤。在野外环境中,很多地区都存在氟超标的现象,对周边地区人群以及动物植物造成很大危害。氟超标会引起禽类肝脏、大脑等器官出现严重的病理损伤和超微结构变化,例如炎性浸润、产生大量出血点、线粒体损伤等。铁死亡是近年来新提出的一种细胞死亡方式,其主要表现为铁积累、脂质过氧化、线粒体膜增厚以及活性氧的产生等。中性粒细胞外捕网(Neutrophil external traps,NETs)是一种中性粒细胞活化机制,其过度积累会导致炎症的加强。然而到目前为止,氟导致的组织损伤是否与铁死亡有关以及氟导致NETs形成的机制尚不明确。为了阐明上述问题,本试验首先对松嫩平原内的自然保护区:龙凤湿地自然保护区、查干湖自然保护区的水体和底泥以及向海自然保护区水体中的氟含量进行了检测。之后本研究将120只1日龄的罗斯308肉鸡随机分为4组,每组30只,基于环境样品检测的氟离子浓度以及毒理学浓度,确定四组日粮中NaF的浓度,饲养周期为42天。分别在日粮中添加不同浓度的NaF使对照组(C组)、低氟组(LF组)、中氟组(MF组)、高氟组(HF组)的日粮中氟离子的浓度分别为0、500、1000、2000mg/kg,用以复制野外氟中毒禽类模型。采用H&E染色、透射电镜观察、转录组学和代谢组学联合分析、油红O染色、免疫组化、实时荧光定量PCR、免疫印迹、流式细胞术等方法确定氟引起禽类肝脏损伤的具体机制。之后在体外使用鸡胚原代肝细胞和LMH细胞加以验证。采用荧光染色、细胞活力检测、实时荧光定量PCR、免疫印迹、添加氧化应激抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、铁死亡抑制剂(Fer-1)、钙离子通道抑制剂硝苯地平(Nifedipine)等手段对氟引起鸡外周血NETs的具体机制加以探究。通过检测脑组织中趋化因子的表达、NETs的生成情况、建立中性粒细胞和神经元细胞共培养体系等方式,以期阐明氟引起的NETs在脑部炎症中的作用。研究结果如下:(1)对龙凤湿地自然保护区的7个采样地点进行了氟含量检测发现,水体中的氟离子浓度为0.9-1.47mg/L,平均值为1.16mg/L,略高于国家标准1mg/L。底泥中的氟离子含量为287-759mg/kg,平均值为502mg/kg,略高于中国土壤背景值480mg/kg。在对查干湖自然保护区检测中发现12个水体采样点的氟离子浓度为0.91-1.47mg/L,平均值为1.24mg/L,8个底泥采样点所检测出的氟离子浓度为408-945mg/kg。向海湿地8个水体采样点中的氟离子含量为三个地区中最高,为2.17-3.26mg/L,平均值为2.47mg/L。结果显示松嫩平原部分地区存在环境中氟超标的现象。(2)F中毒禽类体重降低,肝脏脏器系数增加,肝功能降低。油红O染色显示肝脏中脂质积累随浓度增加而减少。组织病理学观察显示随着F浓度的增加肝脏出血点增多,出现炎性细胞浸润。超微结构观察显示MF组和HF组均出现线粒体结构异常和空泡化。采用转录组学和代谢组学联合分析发现FOXO信号通路、谷胱甘肽代谢异常、鞘脂代谢、神经活性配体-受体相互作用等途径有显著变化。之后检测了肝脏组织中铁积累情况以及氧化应激相关标志物(T-AOC、CAT、MDA、GSH)的水平。采用qRT-PCR以及WB从转录和翻译水平对FOXO信号通路、氧化应激相关通路、铁死亡相关因子进行检测。发现F可以使肝脏中铁含量升高,发生氧化应激,激活FOXO信号通路、Nrf2信号通路导致铁死亡的发生。在体外试验中采用原代鸡肝细胞以及LMH细胞通过CCK-8、qRT-PCR、WB、铁离子和ROS荧光染色、流式细胞术等手段发现氟可以在体外引起肝细胞以及LMH细胞FOXO通路激活,并且引起氧化应激的发生和铁积累的现象,引起铁死亡。另外氟也可以引起细胞周期阻滞在S期,使DNA合成受阻,导致细胞死亡。(3)首先采用不同剂量的NaF(0m M、0.25m M、0.5m M、1m M)诱导NETs生成,再与佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)的诱导效果进行对比筛选出体外诱导NETs的最佳剂量。之后采用qRT-PCR的方法对NETs形成相关基因(MPO、NE、H3、NOX-2、PKCα、PKCβ、PKCζ)进行转录水平的检测,采用WB和免疫荧光对MPO、NE进行了蛋白水平的检测,结果发现NaF诱导鸡外周血NETs的最适浓度为1m M。随后采用Hoechst染色观察NETs的生成情况,Fe Rh Nox-1探针观察NETs形成过程中Fe~(2+)的积累情况,以及采用Fer-1和NAC处理观察谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的变化。结果发现Fer-1能明显减Antiviral medication少NaF诱导的NETs生成,但不能减少PMA诱导的NETs的产生,NAC对于PMA和NaF均有抑制抑制作用。此外在NaF诱导NETs的形成过程中观察到了Fe~(2+)的积累,这种积累可以被Fer-1所缓解,而在PMA作用下并未观察到此现象。GSH和MDA的检测结果显示Fer-1和NAC可以缓解NaF所引起GSH下降和MDA升高。(4)Fer-1的预处理会抑制NETs生成相关指标(MPO、NE)和铁死亡相关指标(GPX4、SLC7A11、FTH1、NCOA4、ALOX12)的基因和蛋白的表达,但是Fer-1不会缓解NaF所导致的线粒体去极化。接下来采用Fluo-4AM钙离子荧光探针对NaF作用下中性粒细胞Ca~(2+)积累情况加以检测,结果发现NaF会使中性粒细胞内Ca~(2+)含量上升,但是Fer-1并不能挽救这一现象。采用L-型钙离子通道(LTCC)抑制剂硝苯地平(Nifedipine)预处理中性粒细胞,发现Nifedipine可以通过抑制LTCC相关蛋白的表达(p-CAMKII、CAMKII、CACNA1D)降低NaF引起的Ca~(2+)增加以及铁死亡的发生。通过线粒体膜电位检测试剂盒JC-1检测线粒体膜电位,WB和Hoechst染色检测铁死亡相关因子和NETs的生成情况发现,Nifedipine可以缓解线粒体去极化现象,并且通过减少铁死亡的方式降低NETs生成相关蛋白的表达。(5)对不同浓度下NaF诱导的大脑组织进行了H&E染色和透射电镜观察,发现有炎性浸润和线粒体损伤的情况出现。接下来对趋化因子(CCL1、CCL4、CCL17、CSCL12、CXCL13、CXCL14)进行检测,结果表明在NaF作用下脑组织中会募集中性粒细胞。之后对脑组织进行铁死亡、NETs和LTCC相关指标检测发现NaF会引起脑组织发生铁死亡并且脑组织中LTCC开放,NETs生成也增多。最后构建了中性粒细胞和原代神经Naporafenib体内实验剂量元细胞共培养模型,发现NaF可以通过引起NETs的方式加重神经元细胞的炎症反应。综上所述,松嫩平原部分地区存在氟超标的现象,高氟日粮会引起禽类肝脏发生铁死亡从而造成肝脏损伤,转录组学和代谢组学联合分析发现,NaF通过SIRT1/FOXO3通路诱导肝脏铁死亡,体外采用原代肝细胞以及LMH细胞对此结论进行了验证。另外过量的NaF可以通过引起中性粒细胞铁死亡的方式诱导NETs的生成,并且加强了脑部的炎症反应。本研究的创新点是首次将野外氟含量调查与实验室模型相结合,开展环境毒理学相关的研究,其次通过多组学联合分析的手段将氟中毒与铁死亡和肝脑轴的调控进行相关检测。并且首次从铁死亡的角度探讨氟对机体的损伤机制,并对NaF引起NETs的生成原因加以探讨,为氟诱导机体损伤提供了重要理论依据和数据支持,丰富了氟相关的生物学内容。