家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是一种有囊膜的DNA病毒,在其生命周期中可产生两种表型的病毒粒子,包埋体衍生型病毒粒子(occlusion-derived virions,ODV)和出芽型病毒粒子(budded virions,BV)。ODV介导病毒在昆虫中肠内的初次感染,而BV介导病毒在虫体内系统性感染。BmNPV是蚕业生产中一种严重的病毒性病原体,尚无有效的药物或针对性的预防措施。GP64是介导BV感染关键的的膜融合蛋白,也是病毒入侵宿主和出芽过程中所必需的蛋白,而目前对BV进入宿主细胞的机制了解有限。本课题组前期研究证明BmNPV感染宿主细胞完全依赖于胆固醇,其中GP64中能与胆固醇结合的胆固醇共识氨基酸基序(cholesterol recognition amino acid consensus,CRAC)1与CRAC2在BmNPV感染中发挥关键作用。CRAC的镜像结构CARC也能与胆固醇互作,但GP64中CARC基序在病毒感染中的活性未知,为进一步探索BmNPV的入侵机制,本文针对BmNPV GP64CARC基序的活性位点开展了以下研究。首先,本论文对GP64中预测的CARC基序进行生物学活性分析,明确其是否为BmNPV感染必需的活性区域。为了进一步探索病毒GP64中的胆固醇结合位点,生物信息学分析预测GP64序列胞外区存在6个CARC基序。再对CARC中关键芳香族氨基酸进行定点突变,并利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建重组病毒,根据病毒感染性和蛋白表达情况确定4个CARC基序的芳香族氨基酸(CARC1、CARC2、CARC3、CARC4)是病毒感染必需的活性位点。其次,研究中构建多个瞬时表达载体,用于探索CARC关键氨基酸突变对GP64表达及融合性的影响MCC950纯度。结果表明CARC的芳香族氨基酸突变不会影响GP64蛋白三聚体的形成及其在细胞膜表面的定位,但CARC的位点突变会影响GP64介导的膜融合效率,其中CARC1、CARC2、CARC3的位点突变直接导致GP64丧失膜融合活性;与野生型GP6ZD18394膜融合活性相比,其余CARC的位点突变导致了蛋白膜融合活性显著降低。最后,利用人工合成的CARC多肽序列,更精确的验证了BmNPV GP64关键CARC区域可以与Bm N细胞结合,并且其结合能力受细胞表面胆固醇含量的影响。其次,BmNPV GP64的信号肽序列(signal peptide,SP)在翻译后修饰途径中没有发生切割,这主要是SP的n区引起的,导致了携带细胞膜定位的GP64病毒(v GP64)相较于携带细胞质定位的GP64病毒(v SP~(Δn)GP64)有更多感染特性。本论文对SP~(Δn)GP64中的CARC活性展开分析。发现信号肽被切割后,只有CARC2和CARC3是病毒入侵所必须的关键基序。这表明,CARC1和CARC4是信号肽未切割情况下的特殊CARC位点,这两个位点除了与胆固醇结合外还存在其他功能。最后,研究对于前Medical professionalism期发现的CRAC1及CRAC2双突变病毒(v GP64~(Y269&327A))进行分析,该病毒在感染过程中不依赖于胆固醇。研究分别比较了野生型病毒(v GP64)和突变病毒(v GP64~(Y269&327A))中CARC的活性,确定了v GP64~(Y269&327A)入侵所必须的CARC1和CARC4基序,并且确定非关键位点的突变不能使重组病毒逃避胆固醇入侵细胞。这再次暗示部分CARC位点除与胆固醇结合外还存在其他功能。本论文详尽的探索了BmNPV GP64中CARC基序在病毒感染过程中的生物学活性,通过对比三种病毒的异同,进一步了解细胞表面胆固醇在病毒入侵中的作用,为深入探索BmNPV的入侵机制奠定基础。