干旱是限制全球农业生产最主要的环境因素之一,干旱胁迫下植物会积累大量次生代谢物来抵抗逆境。东莨菪苷作为一种糖基化的香豆素,是植物中常见的次生代谢物,由UDP-葡萄糖基转移酶(UGT)催化合成。而东莨菪苷与植物耐旱性的关系尚不明晰。白花草木樨(Melilotus albus)是一种集饲用、绿肥、蜜源多用途的二倍体草本Medical drama series植物,是重要的轮作牧草,耐旱性强。然而,白花草木樨东莨菪苷生物合成基因及其是否通过调节东莨菪苷积累来提高植物耐旱性的分子机理尚且未知。本研究利用BSA(Bulked segregant analysis)、过表达以及RNAi(RNA interference)等方法开展参与白花草木樨东莨菪苷合成的UGT79基因鉴定、耐旱特性及MaMYB4和MabHLH11的转录调控研究,对阐明东莨菪苷的生物合成以及解析白花草木樨耐旱性强的分子机制具有重要意义。主要结果如下:1.全基因组水平鉴定了189个白花草木樨UGT基因家族成员。白花草木樨UGT基因家族成员不均匀地分布在8条染色体上。系统进化分析表明白花草木樨UGT可以分为13组,其中E组数量最多。共有76个MaUGT基因家族成员含有内含子序列,其中Inron-4(4号内含子)是高度保守的内含子。不同组织的转录组分析显示MaUGT在白花草木樨中具有组织表达特异性,16个MaUGT基因均在近等基因系JiMa46与JiMa49中差异表达,地上部和根中分别有73.55%和66.67%的MaUGT基因在非生物胁迫下差异表达,表明大多数MaUGT基因可能参与白花草木樨的发育、次生代谢产物的合成以及对非生物胁迫的响应。2.定位到东莨菪苷生物合成的关键基因MaUGT79。基于近等基因系BSA分析,将白花草木樨东莨菪苷生物合成基因定位到5号染色体67,539,223 bp至6Tezacaftor纯度7,540,565 bp区间内,该区间为一个编码UDP-葡萄糖基转移酶编码基因MaUGT79,该基因的编码区存在6个SNP和一个邻近的10 bp的Indel,这个Indel缺失能够引起移码突变导致蛋白翻译提前终止。MaUGT79在JiMa46和JiMa49的根中差异表达,且受干旱胁迫诱导表达。烟草亚细胞定位分析发现MaUGT79蛋白定位在细胞质和细胞核。证实体外重组蛋白MaUGT79能以UDP-葡萄糖为糖供体,以东莨菪内酯为底物,催化合成东莨菪苷。过表达MaUGT79显著增加了转基因毛状根中东莨菪苷含量,RNAi-MaUGT79则显著降低了转基因白花草木樨毛状根中东莨菪苷含量。在干旱胁迫处理下,过表达MaUGT79的转基因毛状根中丙二醛(MDA)、H_2O_2和O_2~-含量显著降低,东莨菪苷含量显著增加,干旱标记基因表达量显著上调,拥有转基因根系的白花草木樨嵌合体植株耐旱能力显著提高。初步证实MaUGT79介导白花草木樨东莨菪苷生物合成,通过干旱胁迫下清除活性氧从而提高植物耐旱能力。3.MaMYB4正调控MaUGT79表达调节东莨菪苷积累,从而提高植物耐旱性。MaUGT79启动子序列存在MYB类转录因子结合位点,生物信息学分析鉴定了一个候选转录因子MaMYB4。烟草亚细胞定位表明MaMYB4定位于细胞核。MaMYB4受干旱胁迫诱导表达。酵母单杂交(Yeast-one hybrid,Y1H)实验证明MaMYB4可以结合MaUGT79启动子的-1609至-1201 bp上游序列,进一步通过双荧光素酶报告(Dual-luciferase Reporter)实验证明,MaMYB4可以激活MaUGT79基因的表达。MaMYB4过表达转基因毛状根中,MaUGT79的相对表达量显著提高,东莨菪苷的含量显著高于对照。干旱胁迫下过表达MaMYB4转基因毛状根中MDA、H_2O_2和O_2~-含量显著降低,MaUGT79的表达则显著上调,拥有转基因根系的白花草木樨嵌合体植株耐旱能力显著提高;而RNAi转基因毛状根表现相反。由此,初步解析了转录因子MaMYB4结合MaUGT79启动子,上调该基因转录水平,进而正调控东莨菪苷生物合成和植物耐旱性的分子机制。4.MabHLH11转录因子可以和MaMYB4互作调控东莨菪苷积累。烟草亚细胞定位表明MabHLH11定位于细胞核。MabHLH11受干旱胁迫诱导表达。酵母双杂交(Yeast-two hybrid,Y2H)和双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescent Complimentary,BAdezmapimod分子式i FC)证明了MaMYB4能与MabHLH11互作。双荧光素酶报告实验、MaMYB4和MabHLH11共转化白花草木樨实验结果显示,MabHLH11和MaMYB4都可以激活MaUGT79的表达,并且MabHLH11和MaMYB4相互作用可以增加MaUGT79的表达,最终形成复合体促进东莨菪苷的积累。综上所述,本研究定位并鉴定了一个UDP-葡萄糖基转移酶基因MaUGT79,解析了该基因参与东莨菪苷生物合成和应答干旱胁迫的分子机制,发掘了上游调控因子MaMYB4,从而揭示干旱诱导MaMYB4调控MaUGT79表达及东莨菪苷积累的分子基础,进一步发现MabHLH11与MaMYB4互作并调控东莨菪苷的生物合成。本研究揭示了植物通过积累东莨菪苷适应干旱逆境的调控机制,为白花草木樨分子改良和种质创新提供重要的理论依据和基因资源。