目的:胶质瘤是神经系统中最常见的原发恶性肿瘤,占脑恶性肿瘤的80%,具有高复发率、高致死率等特点,其中位生存期仅为2-5年。其中胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)患者的中位生存期仅约为15个月。针对胶质瘤的治疗,目前多采取外科手术为主并辅以术后放化疗的综合治疗策略。替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)由于其能够穿透血脑屏障的特性,是目前化疗方案中的最常用的药物。然而长期用药后,胶质瘤经常表现出对TMZ的耐药,这也是胶质瘤治疗失败的主要原因。因此,提高胶质瘤对TMZ的敏感性对于提高胶质瘤患者的生存率至关重要。越来越多的证据表明,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)对肿瘤的发生发展和对治疗的反应至关重要,而胶原蛋白又是构成ECM最主要的蛋白质成分,对胶原蛋白的研究可能为实体肿瘤的治疗提供新线索。已有研究证实,过量胶原蛋白的合成可以干扰细胞极性与细胞粘附并最终促进癌细胞的增殖与迁移。此外,ECM中胶原蛋白的沉积阻碍了大分子的扩散,从而降低了药物的渗透和功能。现在关于胶原蛋白影响胶质瘤发展与预后的研究尚不多见,针对胶原蛋白合成的研究可能会为治疗胶质瘤提供新启示。胶原蛋白的生物合成涉及多个复杂的过程,其中脯氨酰4-羟化酶是胶原蛋白合成中的关键酶之一,脯氨酰4-羟化酶亚基α-2(proline4-hydroxylase subunit alpha 2,P4HA2)基因负责编码该活性酶催化位点的主要部分,过表达该基因可导致其下游产物胶原蛋白的合成显著增加。已知P4HA2在多种癌症中表达失调,且高表达与癌症进展及较差预后相关,然而其对胶质瘤细胞TMZ敏感性的影响尚无人报道。转录因子(Transcription factors,TF)是一类能与特异性DNA序列结合并调节基因转录的调控蛋白,也对肿瘤的发生和发展发挥重要作用。作为转录因子,CCAAT增强子结合蛋白β(CCAAT Enhancer Binding Protein Beta,CEBPB)在细胞基本过程中发挥重要作用,同时也被证实在多种肿瘤中与恶性生物学行为及耐药基因转录相关,然而目前该基因的功能研究尚浅,未见其关于TMZ耐药与ECM构建的相关研究。异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate Dehydrogenase,IDH)是胶质瘤分子分型的重要分子指标,对胶质瘤的个体化治疗及临床预后判断具有重要意义。大量证据表明相比于异柠檬酸脱氢酶1(Isocitrate Dehydrogenase 1,IDH1)野生型胶质瘤,IDH1突变型胶质瘤对TMZ的治疗更敏感。本研究旨在发掘该现象背后的潜在机制,探究CEBPB、P4HA2对胶质瘤细胞的恶性生物学行为、TMZ敏感性及胶原蛋白合成的影响,为胶质瘤的治疗提供新靶点。研究方法:1、生信分析TCGA与GTEx数据库中CEBPB和P4HA2在正常脑组织(normal brain tissues,NBTs)和胶质瘤组织中的表达水平;2、免疫组化检测CEBPB和P4HA2在NBTs、胶质瘤组织中的表达水平;3、q RT-PCR检测CEBPB和P4HA2在正常星形胶medical sustainability质细胞和胶质瘤细胞系(U87、U251)中的表达水平;4、Western blot(WB)检测CEBPB、P4HA2和胶原蛋白在胶质瘤组织和细胞系中的表达水平;5、胶质瘤细胞系(U87、U251)稳定转染CEBPB、P4HA2敲减(knockdown,KD)与过表达(Overexpression,OE)质粒;6、平板克隆实验及Ed U实验检测细胞增殖能力;7、Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力;8、CCK-8实验检测细胞对TMZ敏感性;9、胶质瘤细胞系(U87、U251)稳定转染IDH1-WT、IDH1-R132H过表达慢病毒;10、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)实验以及WB实验检测过表达IDHCompound 3半抑制浓度1-132H对CEBPB泛素化降解的影响;11、染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)实验验证CEBPB与P4HA2启动子区存在结合作用;12、HEK239T细胞共转染P4HA2完整/截短启动子区及CEBPB过表达载体,双荧光素酶报告实验验证CEBPB与P4HA2的调控关系;13、裸鼠皮下移植瘤实验检测肿瘤成瘤能力;14、Masson三色染色法检测在体胶质瘤胶原蛋白的表达。15、裸鼠颅内原位移植瘤实验检测裸鼠生存期。结果:1、相比正常脑组织与IDH1突变型胶质瘤,P4HA2在IDH1野生型胶质瘤中高表达并与不良预后相关;2、与Scramble组相比,敲减P4HA2可显著抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和胶原蛋白的合成,并增加其对TMZ敏感性。与Empty vector组相比,过表达P4HA2可显著增加胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和胶原蛋白的合成,并降低其对TMZ敏感性;3、P4HA2及其互作蛋白功能主要富集在ECM的构建、胶原蛋白的组成上;4、相比IDH1突变型胶质瘤,胶原合成相关基因(P4HA2、P4HB、COL1A1、COL3A1、COL4A2、COL5A1、COL5A2、COL8A2、COL12A1和COL15A1)在IDH1野生型胶质瘤中高表达;5、CEBPB与胶原合成相关基因表达正相关,可能是该基因集的转录因子;6、相比正常脑组织与IDH1突变型胶质瘤,CEBPB在IDH1野生型神经胶质瘤中高表达并与不良预后相关;7、与Scramble组相比,敲减CEBPB可显著抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和胶原蛋白合成,并增加其对TMZ敏感性。与Empty vector组相比,过表达CEBPB显著增强胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和胶原蛋白合成,并降低其对TMZ敏感性;8、CEBPB在IDH1-R132H过表达胶质瘤细胞中蛋白表达更低,且低表达可以被MG-132回复;9、相比IDH1-WT过表达胶质瘤细胞,CEBPB在IDH1-R132H过表达胶质瘤细胞中泛素化水平更高;10、CEBPB可以与P4HA2启动子区(TTTGGGCAAC)结合,并且促进P4HA2的转录;11、与Control组相比,CEBPB KD+P4HA2 KD组显著降低了胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和胶原蛋白的合成,以及增加其对TMZ的敏感性,CEBPB OE+P4HA2 OE组显著增加了胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和胶原蛋白的合成,以及降低其对TMZ的敏感性;而CEBPB KD+P4HA2 OE组或CEBPB OE+P4HA2 KD组相比Control组,在胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭以及TMZ敏感性上无显著统计学差异;12、裸鼠皮下移植瘤实验结果显示,与Scramble组相比,CEBPB KD组、P4HA2 KD或CEBPB KD+P4HA2 KD组瘤体生长速度较慢,最终形成的瘤体体积较小,瘤中胶原蛋白形成较低,且CEBPB KD+P4HA2 KD组相较于单一敲减组瘤体生长速度更慢,形成的瘤体体积更小,瘤中胶原蛋白形成更低。裸鼠颅内原位移植瘤实验结果显示,与Scramble组相比,CEBPB KD组、P4HA2 KD或CEBPB KD+P4HA2 KD组的裸鼠生存期更长,且CEBPB KD+P4HA2KD组相较于单一敲减组裸鼠生存期更长。结论:1、CEBPB和P4HA2在IDH1野生型胶质瘤组织和细胞中高表达,且与不良预后相关。2、敲减P4HA2或CEBPB能够抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为和胶原蛋白的合成,以及增加TMZ的敏感性。过表达P4HA2或CEBPB能够增加胶质瘤细胞的恶性生物学行为和胶原蛋白的合成,以及降低TMZ的敏感性。3、CEBPB通过与P4HA2的启动子区结合,促进其转录,从而发挥其促癌以及胶原蛋白合成的作用。4、IDH1突变与胶原合成相关基因的转录表达成负相关。5LBH589小鼠、CEBPB是胶原合成的关键转录因子,且在IDH1突变的胶质瘤细胞中更易被泛素化降解。6、单独或联合敲减CEBPB及P4HA2可显著抑制裸鼠移植瘤的生长与瘤内胶原蛋白的合成,并延长裸鼠的生存期。