背景幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylor)感染是诱发胃炎、消化性溃疡、胃癌的主要病因,清除幽门螺杆菌对以上疾病的预防及治疗均有益。目前,幽门螺杆菌对常用抗生素的耐药性日益增强,临床上将阿莫西林作为治疗幽门螺杆菌感染的首选用药。但随着阿莫西林的广泛应用,幽门螺杆菌对阿莫西林的耐药性逐年上升。了解幽门螺杆菌对阿莫西林的耐药机制有助于提高阿莫西林的杀菌效果,推动新型抗菌药物的发现。现有研究表明,幽门螺杆菌青霉素结合蛋白(PBPs,Penicillin binding proteins)的突变是幽门螺杆菌对阿莫西林耐药的主要机制。但外排泵高表达,膜通透性改变也会介导幽门螺杆菌对阿莫西林耐药性的产生。这暗示幽门螺杆菌对阿莫西林的耐药存在新机制,幽门螺杆菌可通过多种机制应对阿莫西林的杀伤。目的在体外诱导选择幽门螺杆菌阿莫西林耐药菌株的基础上,通过转录组测序对耐药菌株和敏感菌株表达差异基因进行鉴定,探讨幽门螺杆菌对阿莫西林耐药的新机制,为临床患者分型、阿莫西林的合理使用提供有效的指导。材料方法1.利用药物浓度递增法体外诱导及选择幽门螺杆菌阿莫西林耐药株。2.利用荧光累积试验测定不同菌株胞内荧光染料H33342的累积量。3.利用荧光酶标仪和流式细胞仪检测不同菌株胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的产量。4.利用转录组测序分析筛选差异表达基因。5.利用同源重组法构建关键差异基因的缺失突变株。6.利用琼脂稀释法、细菌单克隆形成实验、生长抑制曲线比较不同菌株对阿莫西林的耐受性。7.利用qRT-PCR检测相关基因在mRNA水平的表达。8.利用二代测序技术检测分析相关基因的突变情况。9.利用原核表达蛋白技术进行目的蛋白的诱导表达及纯化。10.利用EMSA检测目的蛋白与DNA序列的特异性结合。11.利用试剂盒检测不同菌株胞内镍离子含量。结果1.体外成功诱导选择幽门螺杆菌阿莫西林耐药株AmoRS。检测发现AmoRS菌株阿莫西林靶基因pbp1A序列发生多处突变,G595S突变为耐药相关突变。2.膜通透性不参与AmoRS菌株对阿莫西林的耐受性。荧光酶标仪结果显示WT菌株和AmoRS菌株胞内药物积累量无差异。3.耐药株AmoRS抗氧化能力增强。通过对比WT菌株和AmoRS菌株胞内ROS产量,发现AmoRS菌株胞内ROS产量明显低于WT菌株。4.烷基过氧化氢还原酶AhpC参与幽门螺杆菌对阿莫西林耐药。与WT菌株相比,阿莫西林处理WT组、AmoRS菌株中ahpC高表达,通过比较不同菌株对阿莫西林的耐受性,发现ΔahpC菌selleckchem Taurine株对阿莫西林的敏感性高于WT菌株,AmoRSΔahpC菌株对阿莫西林的耐受性明显低于AmoRS菌株。5.镍摄取调节蛋白NikR调控AhpC的表达。已知NikR有apo、holo两种蛋白构象,镍离子充足时,以holo-NikR存在。通过比对启动子序列保守区域发现ahpC启动子存在NikR的结合位点;进一步通过EMSA研究证明holo-NikR结合ahpC。qRT-PCR结果显示与WT菌株相比,ΔnikR菌株中ahpC低表达。这表明AmoRS菌株胞内镍离子含点击此处量多,holo-NikR大量存在,AhpC高表达。6.镍转运蛋白ExbB高表达导致AmoRS菌株胞内镍离子含量增加。检测细菌胞内镍离子浓度发现,与WT菌株相比,AmoRS菌株胞内镍离子含量增多。分析镍转运蛋白差异表达基因发现,与WT菌株相比,exbB在AmoRS菌株中高表达,但已知holo-NikR抑制exbB,这提示AmoRS菌株中NikR对exbB的抑制力下降。7.AmoRS菌株中nikR核苷酸序列突变导致对exbB抑制力下降。通过检测nikR基因核苷酸序列及exbB启动子序列,发现与WT菌株相比,nikR DNA序列3’端发生突变。本课题将突变型NikR蛋白命名为NikR(M)。EMSA检测发现holo-NikR(M)对exbB的结合力下降,对ahpC的结合力无变化。8.ExbB通过降低ROS参与AmoRS菌株对阿莫西林耐药。由于ExbB高表达,将其敲除,通过比较AmoRS菌株、AmoRSΔexbB菌株对阿莫西林的耐受性,发现AmoRSΔexbB菌株对阿莫西林的敏感性升高;通过对比AmoR5菌株与AmoRSΔexbB菌株胞内ROS产量,发现AmoRSΔexbB菌株胞内ROS产量高,且qRT-PCR结果显示ahpC低表达,这表明ExbB高表达是耐药的重要因素。9.ROS能够引起NikR发生类似镍离子诱导的apo-holo态变构反应。由Medial pivot于WT菌株胞内镍离子浓度低,考虑到抗生素处理可导致细菌胞内产生ROS,通过EMSA检测发现H2O2处理NikR后可与exbB、ahpC启动子结合。结论本课题首次发现AhpC通过降低胞内ROS参与幽门螺杆菌阿莫西林耐药性的形成,其表达受NikR调控。