研究背景:肾纤维化(RF)是几乎所有慢性肾脏疾病(CKD)发展到终末期的病理基础,肾活检可明确诊断RF,且是唯一方法,但此方法具有侵入性,对终末期肾病患者的风险大,可导致出血问题,因此,需寻找更容易获得的特异性肾纤维化生物标志物;其次,尽管在了解该疾病的病因方面取得了重大进展,但肾纤维化的基本机制尚未得到充分研究。STATs的激活可能是肾损伤和瘢痕的重要标志物,许多进行性肾脏疾病以持续炎症为特征,响应和转导炎症信号的主要途径之一是JAK-STAT途径,这说明需进一步研究JAK-STAT通路与RF发病机制的关系。孙伟教授将RF的病机精简概括为“肾虚湿瘀”,基于“护肾延衰”的理念,开创“益肾清利活血”法。中药单体丹参酮ⅡA是活血祛瘀中药丹参的主要成分,具有“清利活血”之效,已证实对肺、肝等脏腑的纤维化均有治疗作用,但于治疗RF机制尚不明晰,需进一步探究。研究目的:1.揭示肾纤维化免疫浸润相关诊断基因;2.阐明丹参酮ⅡA改善RF的作用;3.揭示丹酮ⅡA对JAK2-STAT3通路调控延缓RF的分子机制。研究方法:1.生信分析:差异表达基因(DEG)通过“limma”R包获得,通过CIBERSORT分析计算每个样品中免疫细胞的富集评分,采用加权基因共表达网络分析(WGCNA)分析和ImmPort数据库发现差异浸润的免疫细胞相关模块和基因,通过MCODE插件鉴定蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的中枢基因,采用受试者工作特征(ROC)曲线验证HuMulti-functional biomaterialsb基因的诊断价值,并利用非编码RNA(miRNA)-Hub基因和转录因子(TF)-hub基因调控网络来解释Hub基因的调控机制,最后检测Hub基因在验证集中的表达。2.网络药理学研究:首先使用中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP)检索丹参的有效成分及靶点,并利用UniProt数据库规范靶点蛋白,然后利用GeneCards、OMIM、NCBI为数据库检索人类疾病靶点,与丹参靶点取交集获取丹参治疗RF的可能作用靶点。接着利用Cytoscape软件构建“药物-成分-靶点”网络,通过STRING数据库构建PPI网络并筛选关键靶点,通过仙桃生信分析网站进行丹参与RF共同靶点集的基因本体(GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。最后,获取丹参发挥作用的主要化学成分,对主要成分进行GO、KEGG富集,以明确主要成分作用靶点与发挥作用的核心机制。3.实验研究:离体实验研究中,应用马兜铃酸(AAI)诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)细胞损伤与纤维化,镜下观察细胞形态,并用MTT法检测AAI造模与AAI+丹参酮ⅡIA干预后的细胞存活率。在体实验研究中,采用AAI腹腔注射建立小鼠肾脏损伤与纤维化模型,造模前与进行药物干预后,观察小鼠一定时间内的一般情况如毛发、体态、体重等。通过收集小鼠尿液与血液,检测尿蛋白、血肌酐、尿酸和尿素氮以评估小鼠肾功能的损伤程度,并通过HE和Masson染色观察小鼠肾脏的病理AY-22989说明书改变与纤维化程度,采用Western blot(WB)技术检验纤维化指IACS-10759体内实验剂量标α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)与核心通路STAT3、JAK2的磷酸化程度。结果:1.生信分析:在42个IFTA样本和99个正常对照组样本之间发现了 2692个DEG。CIBERSORT分析表明,9个细胞的浸润存在显著差异,以CD4记忆激活T细胞和γδT细胞最显著。从基于ImmPort数据库的模块基因中获得161个DEIG,之后,通过PPI网络鉴定出 10 个 Hub 基因,分别是 CD40,TLR2,PTPRC,ICAM1,IL1B,CCL5,STAT1,CD86,CD8A和CCR5,尤以CCL5关系最密切,它们均在外部数据集得到验证。最后,从miRNA-Hub基因网络和TF-hub基因网络分析了 Hub基因的调控机制,65个TFs中STAT1和STAT3是JAK-STAT信号通路的重要组成部分。因此,推测γδT细胞通过CCL5趋化因子途径在RF的发生和发展中起重要作用,并且JAK-STAT通路具有重要意义。2.网络药理学:丹参治疗RF是多种成分、多条途径、多个靶点的网络状调控机制。对丹参与RF共靶点富集分析发现,多条与炎症和炎症因子相关通路、细胞氧化应激相关通路被富集,富集结果与RF特征一致。对丹参主要成分丹参酮ⅡA富集后,核心靶点是C型蛋白酪氨酸磷酸酶受体(PTPRC),KEGG得到TCR通路在RF中的重要性。由此,推测丹参酮ⅡA主要通过PTPRC,使活化的物质去磷酸化,以发挥抗RF作用,丹参发挥抗RF的作用与免疫密不可分。3.实验研究:离体研究:AAI显著降低HK-2细胞存活率,丹参酮ⅡA干预后能维持HK-2细胞形态且提高细胞存活率,并呈剂量依赖性。在体研究:对m于AAI腹腔注射诱导的小鼠肾脏损伤与RF模型,丹参酮ⅡA能显著保护小鼠肾脏功能,尿蛋白、血肌酐、尿酸、尿素氮水平上升,且病理损伤及纤维化程度减轻,尤以高剂量组明显。丹参酮ⅡA还能使上调的pJAK2、pSTAT3、α-SMA蛋白的表达下降,高剂量组尤是。结论:1.研究确定了 10个基因作为RF的Hub基因,γδT细胞通过CCL5趋化因子途径在RF中起重要作用,并发现Hub基因与STAT通路关系密切。这些基因和γδT细胞可作为RF诊断的潜在生物标志物;2.丹参酮ⅡA的主要靶点是PTPRC,富集通路是TCR,它们与JAK-STAT通路关系密切;3.AAI腹腔注射能够建立肾脏损伤与RF动物模型,丹参酮ⅡA在体内外具有抗RF的作用;4.丹参酮ⅡA抗RF的潜在分子机制是调控JAK2-STAT3通路。