研究一:临床研究加味黄芪赤风汤对IgA肾病患者血清IL-18和IL-1β表达的影响目的:通过临床随机对照试验,观察加味黄芪赤风汤治疗IgAN患者的有效性和安全性,及其对患者血清IL-18和IL-1β表达的影响。方法:中医辨证为气虚血瘀兼风邪热毒证的80例IgAN患者,随机分为治疗组和对照组,每组40例。同时纳入23例性别、年龄相匹配的健康受试者。健康受试者仅采集一次静脉血,用于检测血清IL-18和IL-1β水平。IgAN患者两组均予以西医基础治疗和替米沙坦治疗,治疗组加用加味黄芪赤风汤颗粒剂进行治疗,治疗周期24周。对治疗前、治疗第12周和第24周的24小时尿蛋白定量和中医证候积分进行分析。血生化指标及血清IL-18和IL-1β水平在治疗前和治疗第24周进行检测。结果:①24小时尿蛋白定量:与治疗前相比,两组患者在第12周的24小时尿蛋白定量明显降低(均P<0.05);第24周的24小时尿蛋白定量进一步下降(均P<0.01)。组间比较显示,与对照组相比,治CHONDROCYTE AND CARTILAGE BIOLOGY疗组在第24周时的24小时尿蛋白定量更低(P<0.01)。②中医证候积分:与治疗前相比,治疗组患者的中医证候积分在第12和第24周均明显降低(P<0.01);对照组患者的中医证候积分在第24周明显降低(P<0.01)。组间比较显示,与对照组相比,治疗组在第12周、第24周的中医证候积分更低(分别P<0.05,P<0.01)。③血清Scr、ALT、AST:治疗前后两组患者血清Scr、ALT、AST组内和组间无统计学差异(P>0.05)。④临床疗效:治疗组总有效率优于对照组(83.78%to 60.61%,P<0.05)。⑤中医证候疗效:治疗组总有效率优于对照组(81.08%to 54.55%,P<0.05)。⑥血清IL-18和IL-1β:与健康受试者相比,IgAN患者治疗前的IL-18和IL-1β水平更高(P<0.01);IgAN患者两组间差异无统计学意义(P>0.05)。治疗组治疗后的IL-18和IL-1β水平均低于治疗前(P<0.01);对照组治疗后的IL-1β水平低于治疗前(P<0.01)。与对照组相比,治疗组的IL-18和IL-1β水平更低(均P<0.01)。结论:加味黄芪赤风汤联合替米沙坦在治疗IgAN患者蛋白尿的临床疗效方面,优于单用替米沙坦,并且可以改善患者中医症状,同时还可以AZD1152-HQPA降低IgAN患者NLRP3炎症小体下游因子血清IL-18和IL-1β水平。研究二:动物实验一 IgA肾病大鼠不同时间点的自噬水平的动态观察目的:在不同时间点对IgAN大鼠肾脏自噬进行检测,观察其体内的动态自噬水平。方法:32只SD大鼠被随机分为正常组(n=13)和IgAN模型组(n=19),IgAN模型组大鼠进行IgA肾病的模型构建。实验第12周从正常组与IgAN模型组各取3只大鼠进行造模鉴定。为了评估不同时间点的自噬的变化,IgAN模型组的大鼠被分为三个时间点,M15、M18和M21(分别对应实验第15、18和21周的取材)。每个时间点随机抽取三只大鼠进行取selleck合成材。正常组的大鼠仅在实验第12周和第21周取材(分别记录为N12和N21)。每3周检测大鼠24小时尿蛋白定量。实验第21周结束进行肾脏取材。Western Blot法检测大鼠肾组织beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62 以及炎症指标 IL-18、IL-1β3 的表达,RT-qPCR 检测 beclin 1、p62mRNA水平,免疫组化检测LC3和beclin 1的表达与分布情况,同时采用透射电镜观察肾脏超微结构及自噬体。结果:①24小时尿蛋白定量:正常组大鼠不同时间点的24小时尿蛋白定量无统计学差异(P>0.05),与正常组大鼠比,IgAN模型组大鼠不同时间点的24小时尿蛋白定量逐渐升高(P<0.01)。②IgAN大鼠模型建立:与正常组相比,IgAN组大鼠系膜区可见明显的IgA免疫荧光沉积。电镜下系膜区可见电子致密物沉积,足细胞足突融合,表明IgAN模型建立成功。③IgAN大鼠自噬增强:实验第12周,Western Blot结果显示,与正常组相比,IgAN组大鼠肾组织beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62的表达上调(分别P<0.01,P<0.01,P<0.05)。免疫组化分析显示IgAN模型组大鼠肾脏beclin 1和LC3的表达明显高于正常组大鼠(均P<0.01)。通过透射电镜证实IgAN模型组存在典型的自噬空泡结构,自噬体呈含有细胞质物质和/或细胞器的双膜结构。④IgAN大鼠不同时间点的动态自噬:Western Blot结果显示,正常组大鼠肾组织自噬水平不随时间变化(均P>0.05)。IgAN模型组大鼠肾组织自噬水平逐渐升高,表现为beclin 1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达的上调和p62表达的下调(均P<0.05)。通过RT-qPCR检测,结果显示,beclin 1和p62mRNA表达水平的变化趋势与观察到的蛋白表达趋势基本一致。免疫组化结果显示与第15周相比,IgAN模型组在第18和21周时beclin1的表达升高(均P<0.01),第18周时LC3的表达升高(P<0.05)。透射电镜对第21周的正常组和IgAN模型组大鼠肾脏自噬进行观察,与正常组大鼠相比,IgAN模型组大鼠存在大量的自噬空泡结构。⑤IgAN大鼠不同时间点的炎症观察:Western Blot结果显示,正常组大鼠肾脏炎症指标IL-18和IL-1β水平不随时间变化(均P>0.05),均处于较低水平。随时间推移,IgAN模型组大鼠IL-18和IL-1β炎症水平逐渐升高(P<0.05)。结论:本次研究,我们观察到了 IgAN大鼠自噬水平的增强,并且进一步通过对不同的时间点的IgAN大鼠肾脏的自噬进行检测,结果显示,IgAN大鼠处于自噬诱导且持续激活的状态,炎症水平亦持续升高。研究三:动物实验二加味黄芪赤风汤抑制自噬降低IgA肾病大鼠NLRP3炎症小体活化的机制研究目的:在实验一的基础上,进一步探讨加味黄芪赤风汤是否可以通过调控自噬途径,降低IgAN大鼠NLRP3炎症小体活化从而改善IgAN大鼠肾脏病理损伤,为今后临床应用加味黄芪赤风汤治疗IgAN提供进一步的理论依据。方法:66只大鼠被随机分为六组:正常组(Normal,n=13),IgAN模型组(IgAN,n=13),加味黄芪赤风汤组(MHCD,n=10),雷帕霉素组(Rapa,n=10),3-甲基腺嘌呤组(3-MA,n=10),加味黄芪赤风汤+3-甲基腺嘌呤组(MHCD+3-MA,n=10)。实验第12周从正常组与IgAN模型组各取3只大鼠进行造模鉴定。之后,再对大鼠进行9周的治疗。治疗组的大鼠给予相应的加味黄芪赤风汤水煎剂(25g/kg/d)或雷帕霉素(1mg/kg/d)灌胃,3-MA(15mg/kg/d)通过腹腔注射给药,而正常组和IgAN模型组的大鼠则灌胃生理盐水直至第21周末。每3周检测大鼠24小时尿蛋白定量。实验第21周结束进行腹主动脉取血和肾脏取材,对血清进行生化指标测定,同时HE、PAS、Masson染色进行肾组织形态学观察,Western Blot法检测大鼠肾脏beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62和NLRP3炎症小体的表达,RT-qPCR检测beclin 1、p62和NLRP3炎症小体mRNA水平,免疫组化检测LC3和beclin 1的表达与分布情况,采用透射电镜观察肾脏超微结构及自噬体,免疫荧光检测NLRP3表达情况。结果:①24小时尿蛋白定量:在第18周和第21周,与正常组相比,IgAN组的24小时尿蛋白定量明显升高(P<0.01)。与IgAN组相比,加味黄芪赤风汤组、3-MA组和加味黄芪赤风汤+3-MA组的24小时尿蛋白定量明显降低(均P<0.01)。②大鼠血生化指标:实验第21周末对大鼠肝肾功能进行测定,包括血清ALB,ALT,AST,BUN和Scr。各指标组间无统计学差异(P>0.05)。③大鼠肾脏病理:采用HE、PAS和Masson染色对各组大鼠肾组织形态进行观察。正常组大鼠肾小球和小管结构正常。IgAN模型组大鼠肾小球可见系膜细胞增生、基质增多,间质炎性细胞浸润。经治疗后,加味黄芪赤风汤组、3-MA组和加味黄芪赤风汤+3-MA组肾组织形态均有一定程度的改善。此外,通过定量分析Masson染色胶原沉积情况,结果表明,与正常组相比,IgAN模型组大鼠有更多的胶原沉积(P<0.01)。与IgAN模型组相比,加味黄芪赤风汤组、3-MA组和加味黄芪赤风汤+3-MA组沉积情况明显改善(均P<0.01);Rapa组沉积程度加重(P<0.05)。透射电镜对各组大鼠肾脏超微结构进行观察。正常组大鼠肾组织结构正常,系膜区未见电子致密物沉积,无足突融合与脱落。IgAN模型组大鼠可见大量系膜区电子致密物沉积,广泛足突融合和脱落。与IgAN模型组相比,加味黄芪赤风汤组、3-MA组和加味黄芪赤风汤+3-MA组沉积的电子致密物均有所减少,且足突融合和脱落情况减轻。④大鼠自噬指标:Western Blot结果显示,与正常组大鼠的肾组织相比,IgAN模型组大鼠的beclin 1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平明显升高(分别P<0.05,P<0.01)。与IgAN组大鼠相比,加味黄芪赤风汤组、3-MA组和加味黄芪赤风汤+3-MA组逆转了大鼠beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达量的增加(P<0.01);Rapa组则进一步促进了 beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达量的升高(P<0.05)。自噬相关蛋白p62与自噬呈负相关,IgAN模型组显著下降(P<0.01),药物干预后,3-MA组和加味黄芪赤风汤+3-MA组逆转了大鼠p62表达量的下降(均P<0.01)。RT-qPCR对大鼠肾组织的beclin 1和p62 mRNA的表达进行检测,结果显示自噬指标在基因层面的表达与蛋白层面的表达基本一致。免疫组化结果亦与之一致。透射电镜下观察各组大鼠肾组织自噬结构,正常组大鼠肾组织结构清晰,偶见自噬体。IgAN模型组大鼠可见大量自噬体聚集,存在典型的自噬空泡结构,有含细胞质物质或细胞器的双膜结构的自噬体,也有单层膜结构的胞浆成分已降解的自噬溶酶体。药物干预后的各组,加味黄芪赤风汤组和3-MA组大鼠自噬体数量减少,加味黄芪赤风汤+3-MA组大鼠自噬结构不明显,而Rapa组大鼠肾组织自噬体数量呈增加趋势。⑤大鼠炎症指标:Western Blot结果显示,与正常组相比,IgAN组大鼠的NLRP3、cleaved caspase-1、IL-18 和 IL-1β 表达水平明显升高(均P<0.01)。与IgAN模型组大鼠相比,加味黄芪赤风汤组、3-MA组和加味黄芪赤风汤+3-MA组可以逆转其表达量的增加(P<0.05);Rapa组则进一步促进了 NLRP3、cleaved caspase-1和IL-1β表达量的升高(P<0.05)。RT-qPCR对大鼠肾组织的NLRP3、cleaved caspase-1、IL-18和IL-1β mRNA的表达进行检测,结果显示炎症指标在基因层面的表达与蛋白层面的表达基本一致。NLRP3免疫荧光结果显示,IgAN模型组大鼠肾脏NLRP3表达增多,加味黄芪赤风汤组、3-MA组、3-MA+加味黄芪赤风汤组NLRP3表达减少,Rapa组NLRP3表达仍然较强。结论:本实验通过建立IgAN大鼠模型,予以自噬增强剂雷帕霉素、自噬抑制剂3-MA以及加味黄芪赤风汤干预,证实了加味黄芪赤风汤治疗IgAN大鼠蛋白尿的有效性和安全性,同时对大鼠肾脏自噬和NLRP3炎症小体等指标进行检测,结果显示加味黄芪赤风汤可能是通过抑制IgAN大鼠体内的过度自噬,降低NLRP3炎症小体的活化,从而减少IgAN大鼠尿蛋白排泄,改善肾脏病理损伤而发挥其肾脏保护作用。