奶牛乳腺炎多由病原微生物感染导致,其中细菌性乳房炎约占90%。血红素加氧酶-1(HO-1)作为一种抗氧化酶,参与细胞炎症、凋亡和自噬反应的调控,与奶牛乳腺炎的研究报道较少。脂多糖(LPS)是细菌性乳腺炎的主要致病因子,能降低细胞中抗氧化酶的表达,使乳腺组织发生损伤和应激,是导致炎症和感染的重要原因。因此LPS常用作体外研究的炎症细胞模型建立。本论文从HO-1参与细胞炎症、凋亡和自噬反应的角度,基于PI3K/mTOR信号通路,借助LPS处理奶牛乳腺上皮(MAC-T)细胞,构建细胞炎症模型,结合外源HO-1和PI3K/mTOR信号阻断剂LY294002或Rapamycin处理细胞。通过pathologic outcomesCCK-8筛选HO-1最佳处理时间和剂量,通过RT-PCR、ELISA和Western blot检测炎症、自噬和凋亡因子,透射电镜观测细胞自噬溶酶体数量,流式细胞术检测细胞凋亡率,阐明HO-1对MAC-T细胞炎症、凋亡、自噬和PI3K/mTOR信号的影响,揭示HO-1调控MAC-T细胞炎症、凋亡和自噬反应的潜在分子机制。结果如下:HO-1在MAC-T细胞中的抗炎作用:CCK-8法检测细胞活力,筛选HO-1处理MAC-T细胞的浓度为0.06μg/mL,作用时间为12 h。结合100μg/mL LPS处理MAC-T细胞12 h。RT-PCR和ELISA检测相关炎性因子mRNA表达和含量。结果显示,LPS诱导细胞中IL-6、IL-8、TNF-αmRNA表达显著上调,同时,IL-6、IL-8、TNF-α在细胞上清液中的含量显著升高。LPS与HO-1共处理组IL-6、IL-8、TNF-αmRNA表达和含量较LPS组显著下降,说明HO-1能在一定程度上减轻LPS诱导的MAC-T细胞炎症反应。HO-1在MAC-T细胞中的抗凋亡作用:RT-PCR和WeKD025研究购买stern blot结果显示MAC-T细胞中Bax与Caspase-3 mRNA和蛋白水平受LPS诱导显著上调,Bcl-2 mRNA和蛋白水平受到明显抑制。与LPS组相比,LPS与HO-1共处理后,Bax与Caspase-3 mRNA和蛋白水平呈现不同程度的降低,Bcl-2 mRNA和蛋白水平显著升高,流式细胞术检测MAC-T细胞凋亡率,结果显示,LPS处理使MAC-T细胞凋亡率显著增加。结合HO-1处理细胞后,MAC-T细胞的凋亡率明显减少。提示HO-1在致炎MAC-T细胞中发挥了抗凋亡作用。HO-1在MAC-T细胞中的抗自噬作用:RT-PCR和Western blot结果显示,MAC-T细胞中LC3B和Beclin1 mRNA水平经LPS处理显著增加,p62 mRNA表达量显著下调,同时LPS促进了LC3II/LC3I比值和Beclin1蛋白表达量,p62蛋白水平受到抑制。与LPS处理组相比,结合HO-1处理后,LC3B和Beclin1 mRNA水平受到不同程度的抑制,p62 mRNA水平显著上调。LC3II/LC3I比值和Beclin1蛋白水平明显降低,p62蛋白水平升高。透射电镜观察显示,LPS组细胞自噬溶酶体数量显著增加,HO-1与LPS联合处理组自噬溶酶体数量较LPS组显著减少。提示HO-1在致炎MAC-T细胞中发挥抑制自噬作用。PI3K/mTOR信号介导HO-1的抗炎作用:结合PI3K/mTOR通路抑制剂LY294002(20μM)或Rapamycin(10 nM)处理细胞,Western blot结果显示,LPS降低了P-AKT/AKT的比值,对PI3K/mTOR信号存在抑制作用;HO-1缓解了LPS对PI3K/mTOR通路的抑制效果,同时,HO-1组上调了P-AKT/AKT的比值,对PI3K/mTOR信号存在激活作用,阻断PI3K或mTOR信号后,HO-1对LPS诱导的炎症反应抑制能力减弱,与LPS和HO-1共处理组相比,MAC-T细胞中IL-6、IL-8、TNF-α的表达上调,ELISA与RT-PCR的结果类似。说明HO-1的抗炎作用是通过激活PI3K/mTOR信号实现的。PI3K/mTOR信号介导HO-1的抗凋亡作用:RT-PCR和Western blot结果显示,阻断PI3K或mTOR信号后,与HO-1和LPS共处理组相比,Caspase-3和Bax mRNA与蛋白表达量上升,Bcl-2 mRNA与蛋白水平下调;流式细胞仪检测结果显示,PI3K或mT确认细节OR抑制剂处理后,逆转了HO-1对炎症细胞的抗凋亡作用,与HO-1和LPS共处理组相比,凋亡率显著升高。提示HO-1依赖PI3K/mTOR信号在炎症MAC-T细胞中发挥抗凋亡作用。PI3K/mTOR信号介导HO-1的抗自噬作用:RT-PCR和Western blot结果显示,阻断PI3K或mTOR信号后,与HO-1和LPS共处理组相比,HO-1的抗自噬作用减弱,LC3Ⅱ/Ⅰ比值与LC3B mRNA水平上升,Beclin1 mRNA和蛋白表达上调,p62 mRNA和蛋白水平受到抑制。提示HO-1依赖PI3K/mTOR信号在炎症MAC-T细胞中发挥抗自噬作用。综上,HO-1能提高细胞活力,抑制炎症MAC-T细胞的炎症、凋亡和细胞自噬活动,HO-1依赖PI3K/mTOR信号在炎症MAC-T细胞中发挥抗炎、抗凋亡和抗自噬作用。