高血压是最常见的慢性病,也是导致心脑血管疾病发生的主要因素。2021年柳叶刀杂志发表的研究表明,全球有12.8亿成年人患有高血压,中国成人高血压患病人数为2.45亿,患病率达23.2%,并呈增长趋势。虽然近20年来,高血压患病率在高收入国家呈稳定或下降的趋势,但在中低收入国家仍不断上升。因此高血压仍然是全世界人口健康面临的一个严峻挑战。原发性高血压是最常见和最重要的心血管疾病之一,是一种以收缩压和/或舒张压升高为特征的全身性疾病。发性高血压是由多种基因、环境和多种危险因素相互作用引起的。原发性高血压所引起的肾脏结构和功能的损害称为高血压肾病(Hypertensive renal disease,HRD),其发病率与高血压程度和累积时间密切相关。HRD是仅次于糖尿病肾病的将会进展成终末期肾病的主要原因之一。HRD的主要临床表现是蛋白尿、血尿和高血压。HRD的标志性改变是肾小球和肾间质的超微结构损伤,引起肾纤维化和肾小球节段性硬化。HRD进展缓慢,早期临床症状不明显易被忽视,进展至终末期肾病将会导致患者生活质量下降,甚至早逝。然而,HRD的发病机制尚未完全阐明,寻找潜在的治疗靶点对HRD的治疗具有重大临床意义。目的:通过蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学联合分析,探索早期高血压肾病的特异蛋白和磷酸化位点及其在高血压肾病发生发展中的作用,为精准医学的潜在靶向蛋白提供线索。方法:本研究选取9只12周龄雄性SHR大鼠和9只相同年龄和体重(约170-220g)的雄性WKY大鼠作为同源对照组,收集大鼠的血压和24小时尿蛋白量,取肾皮质组织样本,-80℃保存用于蛋白质组学检测,残余组织分别用于HE和Masson染色;经PCA分析验证了样本采集策略的保真度和有效性;从组织样本中提取总蛋白经酶解后用于后续分析,采用鸟枪法和非标记定量法进行蛋白质组学测定;Ti O2富集策略富集磷酸化肽段并进行磷酸化蛋白组学测定;差异分析使用配对t检验,获取差异表达蛋白以selleck抑制剂及磷酸化修饰位点;使用wolfpsort软件进行亚细胞定位;利用生物信息学分析(GO、KEGG)对差异分析结果进行基因注释并探索生物学途径的改变;对蛋白质组学联合磷酸化组学分析的结果在TCGA数据库验证并进一步分析。结果:1.HRD肾组织的表型特征SHRs的SBP和DBP均比WKYs高(SHR:SBP,157.58±14.73 mm Hg,DBP,105.81±20.60 mm Hg;WKY:SBP,116.51±9.15 mm Hg,DBP,71.78±7.47 mm Hg;P<0.01);SHRs与WKYs尿蛋白的丢失情况存在显著差异(SHR:12.16±3.12mg;WKY:7.66±2.35mg;P<0.01);肾组织HE和Masson染色结果显示SHRs的肾小球节段性硬化和小管间质损伤(即小管扩张、小管上皮细胞萎缩、系膜基质增多、纤维化、炎症细胞浸润)更为严重;Western blot显示,与WKYs相比,SHRs肾组织中aSMA表达明显升高,提示在SHRs中肾组织存在明显纤维化病变,两组间差异有统计学意义(P<0.MEK抑制剂01)。2.蛋白组学结果本研究共鉴定并定量了4533个蛋白,其中310个在1.5倍以上(152个上调,158个下调)。进一步对310个蛋白进行了亚细胞定位、COG和GO分析,亚细胞定位显示,32.58%富集蛋白定位在细胞质,21.61%定位在细胞核,11.74%定位在细胞外空间。COG功能分类显示,大多数差异表达蛋白在信号转导机制、一般功能预测、翻译后修饰等方面发挥作用。在差异表达蛋白中,有12个蛋白通过其催化活性参与和调节能量的产生和转化过程,如Adhfe1等。根据生物学过程对蛋白质进行分类,HRD中细胞内脂质转运、蛋白活化级联、凝血等生物学过程都显示异常。按分子功能进行的蛋白分类显示与反式-2-烯基-辅酶a还原酶(NADPH)活性有关。在蛋白质组学数据中我们发现有20个谷胱甘肽s-转移酶(GST)家族成员(Gstp1、Gstm1、Gsta1、Gstt1等)差异表达。PRM检测结果与LC-MS/MS数据一致,SHRs中Gstm1和Gstp1水平显著下调(P<0.05),Adhfe1水平显著上调(P<0.01)。我们鉴定并量化了1938个SHRs和WKYs蛋白上的3921Peptide Synthesis个磷酸化位点,与以往的文献相同,选择1.5倍作为变化阈值,P<0.05的标准检测不同位点,根据以上数据和标准,在SHR/WKY可比较组中,共有226个蛋白上的327个磷酸化位点的丰度发生显著变化(FDR≤0.01),其中131个增加,196个减少。与WKYs相比,在SHRs中Adhfe1的磷酸化表达显著上调(P<0.05),Gstm1、Gsta1的磷酸化表达明显下调(P<0.05)。以1.5的变化比为显著阈值,根据SHR/WKY比值分区(Q1(<0.333,88个位点),Q2(0.333～0.667,108个位点),Q3(1.5～3,49个位点)及Q4(>3,82个位点))。亚细胞定位的注释显示,Q1和Q2中许多蛋白位于线粒体的各个部位,Q3和Q4中的蛋白质位于网格蛋白一些部位上。KEGG分析表明,蛋白质在Q1和Q2都浓缩在氧化磷酸化途径,Q3、Q4在RNA转运、长寿调控通路、m TOR信号通路、肌动蛋白骨架调控、癌症调控通路等方面富集。有1938个量化的蛋白质也经历了磷酸化,并量化了3921个磷酸化位点,全局蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学呈弱负相关。在SHRs和WKYs的蛋白质组比较中,Gstm1、Gstp1和Adhfe1的表达水平变化率分别为0.09(P<0.05)、0.43(P<0.05)和3.89(P<0.01),而Adhfe1的磷酸化表达变化率(PEP<0.00001;Score=105.38)为3.905(P<0.01)。结论:1.SHRs血压及尿蛋白升高,肾脏出现肾小球节段性硬化和小管间质损伤等纤维化病变。2.磷酸化低的蛋白质与氧化应激密切相关,SHRs的氧化应激在HRD状态下受到磷酸化的异常调控。3.蛋白质组的表达水平受磷酸化调节,氧化磷酸化在早期就参与了HRD的发生和发展。4.Gstm1和Gstp1通过改变HRD中的蛋白质表达水平发挥作用,Adhfe1通过改变HRD中Adhfe1的蛋白质表达水平和磷酸化发挥作用。5.氧化应激介导LKB1/AMPK/m TOR代谢轴参与调节早期HRD的发生。