研究背景胃癌作为全球发病率高、死亡率高并且极具破坏性的恶性肿瘤之一,是影响人民健康的重大疾病。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染诱发胃部恶性转化涉及宿主细胞蛋白质和非编码RNA(Noncoding RNAs,ncRNAs)等生物活性分子组成的复杂调控网络,环状RNA(Circular RNAs,circRNAs)作为一类新型单链RNA在其中的作用及调控机制受到关注。多项研究发现,circRNA与肿瘤发生发展密切相关。目前仍需明确并深入研究特异circRNA与H.pylori感染相关胃癌发生发展之间的关系。研究目的本课题从不同层次深入分析并阐明H pylori调控hsa_circ_0026228/miR-323a-3p/PPP1CB轴参与胃癌发生发展的作用机理,探索相关关键分子作为胃癌早期诊断、治疗和预后标志物的潜力。研究方法与结果1.H.pylori关键毒力因子CagA可调控特定circRNA-miRNA-mRNA通路分别对H.pylori关键毒力因子 CagA(Cytotoxin-associated gene A)高表达的胃癌细胞AGS及其对照进行高通量测序,使用miRNet等在线数据库及Starbase等分析工具进行生物信息学分析,获得CagA调控的关键circRNAs,并筛选出相关关键miRNAs及中心靶分子,结合胃癌患者生存率及预后分析,提示hsa_circ_0026228/miR-323a-3p/PPP1CB 通路在H.pylori感染相关胃癌发生发展中作用显著。2.分子和细胞水平实验证实H.pylori通过hsa_circ_0026228/miR-323a-3p/PPP1CB通路调控胃癌细胞增殖和侵袭转移(1)分别使用CagA重组蛋白及H.pylori SS1菌株以特定时间和浓度刺激胃癌细胞,RT-qPCR及Western Blot检测结果显示,关键分子hsa_circ_0026228表达下降,miR-323a-3p表达随之上调,PPP1CB mRNA及蛋白水平的表达降低。(2)分别向胃癌细胞中转染hsa_circ_0026228过表达质粒及特异小干扰RNA、miR-323a-3p mimics 及 inhibitors 和 PPP1CB 小干扰 RNA 及过表达质粒,RT-qPCR及Western Blot检测结果显示,与对照组相比,转染均达到实验目的;hsa_circ_0026228可有效降低miR-323a-3p表达,使PPP1CB的表达上升,从而促进P21和E-Cadherin表达。荧光原位杂交(FISH)实验证实miR-323a-3p与hsa_circ_0026228在细胞质中存在共定位;双荧光素酶活性实验表明hsa_circ_0026228 海绵吸收 miR-323a-3p,miR-323a-3p 则直接结合 PPP1CB 的3′-UTR 区。结合回复实验,通过 RT-qPCR、Western Blot、CCK-8、EdU、克隆形成、Transwell和划痕实验证实hsa_circ_0026228通过海绵吸收miR-323a-3p调控PPP1CB表达,参与胃癌细胞增殖与迁移。3.在裸鼠模型和人体病理组织标本水平验证hsa_circ_0026228/miR-323a-3p/PPP1CB通路调控胃癌细胞增殖和侵袭转移裸鼠皮下成瘤实验显示,较对照组,干扰hsa_circ_0026228组的裸鼠体内成瘤能力明显升高;RT-qPCR、Western Blot和免疫组化结果说明hsa_circ_0026228海绵吸收miR-323KPT-330 IC50a-3p调控PPP1CB抑制胃癌细胞增殖。将hsa_circ_0026228高表达及对照质粒转染进胃癌细胞后进行裸鼠尾静脉注射,发现高表达组肝和肺中炎症程度和肿瘤转移灶数量显著减少,说明hsa_circ_0026228抑制胃癌细胞侵袭转移。在人体病理组织样本中通过RT-qPCR和免疫组化实验发现,与癌旁正常样本相比,hsa_circ_0026228及PPP1CB在胃癌组织样本中显著低表达,miR-323a-3p则表达水平较高。实验结论本项研究从中国人病理组织样本、细胞分子及动物模型等多个层次研究H.pylori调控hsa_circ_0026228/miR-323a-3p/PPP1CB轴对胃癌细胞增殖和侵袭转移的影响,以及hsa_circ_0026228与miR-323a-3p及其靶分子Pqatar biobankPP1CB之间的相互调控机制。研究表明,hsa_circ_0026228在胃癌中低表达,可通过吸附miR-323a-3p上调靶PPP1CB进而影响GSK1349572说明书胃癌发生发展进程。本研究可从靶向hsa_circ_0026228/miR-323a-3p/PPP1CB通路出发,为关键分子的H.pylori相关胃粘膜恶性转化防控提供一定的理论基础。