布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella,简称布菌)侵入机体后引发的人兽共患细菌病,具有较强的传染性,在我国被列为乙类传染病。布菌是一种典型的胞内寄生菌,其毒力在于细胞内生存和增殖。布菌通过吞噬作用入侵宿主细胞后,依次形成早期菌泡(Early bacteriophage,e BCV)、复制性菌泡(Replicative bacteriophage,r BCV)、自噬性菌泡(Autophagic bacteriophage,a BCV)。其中,r BCV是通过与内质网互作而形成的,在这个过程中,布菌Ⅳ型分泌系统(TypeⅣsecretion system,T4SS)会启动表达,促进布菌效应蛋白释放进入细胞浆及内质网,结合在内质网上的效应bone biopsy蛋白会诱导内质网应激反应(Endoplasmic reticulum stress,ERS)的发生,进而导致炎症反应的发生。但是布菌效应蛋白是如何调节ERS及炎症反应的发生,目前还未知。本研究意在讨论效应蛋白Bsp I通过ERS对于炎症因子产生的调控作用。布鲁氏菌效应蛋白Bsp I由布鲁氏菌的染色体基因BAB1-1865编码,包含信号肽结构域(1-17Aa)、转膜结构域(17-33Aa)和GTPase活化域(98-220Aa)三个结构域。由于Bsp I蛋白具有不同于其他效应蛋白的特殊结构域,本研究选取Bsp I蛋白为主要研究对象,探讨布菌效应蛋白在诱导细胞ERS反应中的作用,并解析其可能的调节炎症反应的机理机制。首先以B.abortus S19疫苗株为模板,利用PCR扩增布菌Bsp I基因,将其插入真核表达载体p EGFP构建selleckchem RAD001p EGFP-Bsp I表达质粒,然后采用转染试剂将p EGFP-Bsp I表达质粒转染进入Hela细胞。将转染后的细胞通过间接免疫荧光实验(Indirect immunofluorescence assay,IF)将高尔基体、内质网进行染色,然后在激光共聚焦下观察。通过观察发现p EGFP-Bsp I重组质粒仅定位于内质网,表明布菌效应蛋白Bsp I进入细胞后定位于内质网。发生ERS后,机体为恢复内环境稳态会激活未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)。UPR能够激活抑制物阻抗性酯酶1(IRE1)、蛋白激酶RNA样内质网类激酶(PERK)和活化转录因子6(ATF6)三种转录因子。为了进一步探究布菌效应蛋白Bsp I能否参与调节UPR反应以及与哪一种信号分子互作,本研究构建了p CMV6-Bsp I表达质粒,将其转染进入Hela细胞后提取蛋白,利用免疫共沉淀实验(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)探究其与IRE1、PERK、ATF6三种信号分子中的哪一种互作。结果表明布菌效应蛋白Bsp I与IRE1互作,与PERK、ATF6均无互作。得到上述结论后,在接下来的实验中构建了Bsp I基因缺失株,用B.abortus S19疫苗株和Bsp I缺失株感染小鼠原代骨髓巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMDM),通过Western blot分析Bsp I对于三种信号分子磷酸化活性的影响。结果显示Bsp I能够抑制IRE1的激活,但是对于PERK、ATF6没有明显影响。综合上述实验得出结论,即布菌Bsp I蛋白进入胞内能够参与调节ERS和UPR反应,与IRE1互作并且能够抑制IRE1的激活。为了探究布菌效应蛋白Bsp I通过ERS反应对于相关炎症因子的调节作用,在本研究中首先用不同的布菌菌株感染BMDMs,通过ELISA实验检测炎症因子的表达,Bemcentinib体内结果显示Bsp I的缺失导致炎症因子表达上调,而且这种差异与胞内载菌量无关。接下来又将p CMV6-Bsp I表达质粒转染进RAW264.7细胞,探究Bsp I过表达对于炎症因子产生的调节作用。结果显示Bsp I过表达组相较于对照组,IL-6、TNF-α等炎症因子的表达量均明显下降。至此,本研究在细胞水平上证实Bsp I能够负向调节炎症因子的产生。为了进一步验证该结论,本研究进行了体内实验,用B.abortus S19疫苗株和Bsp I缺失株感染小鼠,测定其血清中炎症因子的表达量,结果显示Bsp I缺失后确实会导致炎症因子的分泌量上调,证实了上述体外实验的结论是正确的。最后通过使用IRE1活性抑制剂来检测IRE1的激活与炎症因子的产生之间是否存在调控关系,结果显示Bsp I通过抑制IRE1激酶的激活负向调节炎症因子的产生。综上所述,本研究发现布菌效应蛋白Bsp I进入细胞后定位于内质网,可以参与调节ERS和UPR并与UPR中的IRE1互作,而且能够通过抑制IRE1激酶的激活负向调节炎症因子的产生。该研究的顺利开展使我们更加深入理解由布鲁氏菌病引起的内质网应激反应,并且对于未来深入探究布菌感染引起的炎症因子产生在流产等一系列病症中的作用具有奠基意义。