研究背景和目的:糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是由糖尿病(Diabetes mellitus,DM)引起的最常见的微血管并发症之一,也是导致慢性肾病(Chronic kidney disease,CKD)和终末期肾病的重要原因。DN的发病机制目前尚不完全清楚,近期研究发现线粒体功能障碍可能在DN的发生、发展中起关键作用。迄今,线粒体功能障碍、能量代谢紊乱与DN发生风险的关联,国内外尚鲜见报道。岩藻多糖是一种水溶性多糖,通过调节调节肠道微生物群结构发挥其抗氧化、抗血栓形成、抗炎等生物活性。然而,岩藻多糖对DN的肾脏保护作用机制尚不清楚。因此,本研究拟纳入糖尿病、糖尿病肾病患者,以及正常对照人群,检测、分析患者血清三羧酸循环中间代谢产物水平及其与DN的关联,探讨线粒体功能障碍和能量代谢紊乱在DN发生中的作用;建立24周高脂饮食诱导的早期DN小鼠模型,采用不同剂量的岩藻多糖进行干预,探究岩藻多糖对DN小鼠的肾脏保护作用及机制。研究可为明确线粒体功能障碍在糖尿病肾病发生中的作用,探索机制关联的营养改善措施提供科学依据。方法:本研究采用病例对照研究的方法,纳入2017年1月至2018年12月就诊于青岛某市级医院,确诊为DM和DN的患者,纳入同期在该院常规体检结论为健康的人群作为本研究中正常对照人群(CON)。采用问卷调查收集研究对象的一般人口学特征。采集研究对象血液样本,采用高效液相色谱串联质谱法检测研究对象血清中三羧酸(Tricarboxylic acid cycle,TCA)循环中间代谢产物水平。采用多因素logistic回归方法分析TCA循环中间代谢产物与DN发生风险的关系(第一章)。选用90只8周龄雄性C57BL/6J小鼠,按照体重随机分为6组,每组15只,分别为对照组(NC,0.5%羧甲基纤维素钠溶液+10%kcal饲料,D12450J)、模型组(DM,0.5%羧甲基纤维素钠溶液+60%kcal高脂饲料,D12492)、低剂量岩藻多糖干预组(LFC,50mg/kg岩藻多糖+高脂饲料)、中剂量岩藻多糖干预组(MFC,100mg/kg岩藻多糖+高脂饲料)、高剂量岩藻多糖干预组(HFC,200mg/kg岩藻多糖+高脂饲料)以及阳性对照(二甲双胍,MTF,150mg/kg二甲双胍+高脂饲料)组,每组小鼠每天进行灌胃,饲养期间自由饮水。连续干预24周,在第23周时应用基于经皮测量的异硫氰酸荧光素(FITC-sinistin)消除动力学技术测定肾小球滤过率(Glomerular filtration rate,GFR)。第24周末次灌胃后禁食12小时后处死小鼠。使用16s RNA测序检测肠道菌群,使用GC-MS检测小鼠盲肠内容物短链脂肪酸(Short chain fatty acids,SCFAs)的水平。使用H&E染色和Masson染色观察回肠、肝脏和肾脏组织的病理学特征。免疫组化检测回肠中紧密连接蛋白1(Zona occludens protein 1,ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)以及肾脏中转化生长因子(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、Ⅰ型胶原的表达水平。酶联免疫吸附法测定肝脏和肾脏组织中C-X-C趋化因子配体1(C-X-C chemokine ligand 1,Cxcl1)含量以及血清中脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)水平。化学发光法测定小鼠肾脏中三磷酸腺苷(Adenosine trWnt-C59说明书iphosphate,ATP)的含量。实时定量PCR法测定肾脏线粒体DNA拷贝数,Western-bloting法检测TCA循环关键酶、线粒体呼吸链复合物Ⅰ-Ⅴ(ComplexⅠ-Ⅴ)表达水平(第二章)。结果:1、病例对照研究发现:(1)DM患者和DN患者较一般人群出现明显的TCA紊乱,其中DN患者TCA紊乱较DM患者更为严重,主要表现为:与DM组相比,DN组的丙酮酸(5.71×10~6ng/L vs 13.69×10~6ng/L,p<0.05)、顺式乌头酸(0.86×10~5ng/L vs1.24×10~5ng/L,p<0.05)、异柠檬酸和α-Dinaciclib体内实验剂量酮戊二酸(2.17×10~5ng/L vs 19.96×10~5ng/L,p<0.05)水平较DM组明显升高,琥珀酸水平较DM组明显下降(6.60×10~5ng/L vs 3.95×10~5ng/L,p<0.05)。(2)估计肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,e GFR)与顺式乌头酸、异柠檬酸、丙酮酸和α-酮戊二酸浓度呈负相关关系,与琥珀酸呈浓度正相关关系。2、动物实验结果发现,高脂饲料连续干预24周后,小鼠出现GFR滤过率和尿肌酐水平升高,并出现肾小球肿大和肾小管间质纤维化病理改变,判断为早期DN。(1)岩藻多speech pathology糖干预改善了早期DN小鼠GFR高滤过,降低了尿肌酐水平;岩藻多糖干预改善了H&E染色表现出的肾小球肿大、Masson染色表现出的肾小管间质纤维化,下调了肾脏纤维化标志物TGF-β1、Ⅰ型胶原的表达水平。(2)岩藻多糖通过“肠-肝轴”显著改善了早期DN小鼠肝脏的炎症水平,其具体机制是:岩藻多糖干预调整了早期DN小鼠的肠道菌群结构,增加了Streptococcus、Lactobacillaceae等有益菌的丰度和盲肠内容物中乙酸的浓度;与DM组相比,岩藻多糖干预后显著上调了早期DN小鼠肠道紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达(p<0.05),降低血清中LPS水平(p<0.05),改善肠道内环境稳态,进而降低DN小鼠肝脏促炎细胞因子IL-6、TNF-α和Cxcl1的水平(p<0.05)。(3)岩藻多糖通过肝肾互作改善了早期DN小鼠肾脏线粒体功能,具体机制是:与DM组相比,岩藻多糖显著降低了肾脏中Cxcl1的水平,其趋势与肝脏一致(p<0.05);与DM组相比,岩藻多糖干预后降低了早期DN小鼠肾脏中促炎细胞因子IL-6、IL-1β的水平(p<0.05),增加了抑炎细胞因子IL-10的水平(p<0.05);与DM组相比,岩藻多糖干预较明显改善肾脏中氧化应激水平和TCA循环关键酶水平(p<0.05),增加肾脏线粒体DNA拷贝数、ATP水平和ComplexⅢ、ComplexⅤ的表达量(p<0.05),显著改善早期DN小鼠肾脏中线粒体的质量与数量。(4)岩藻多糖通过改善线粒体功能进而改善早期DN小鼠肾脏纤维化,具体机制是:与DM组相比,岩藻多糖干预后显著下调早期DN小鼠肾脏中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK表达水平(p<0.05),从而降低其下游肾脏纤维化标志物TGF-β1、Ⅰ型胶原的表达水平,进而改善早期DN小鼠肾脏纤维化。结论:DN患者中出现较明显的线粒体功能障碍和能量代谢紊乱,TCA循环中间代谢产物与e GFR密切相关,顺式乌头酸为DM患者发生DN的危险因素,琥珀酸为其保护因素,顺式乌头酸、琥珀酸、丙酮酸联合联合血糖和血清白蛋白对DN有一定的预测作用。岩藻多糖通过改善肠道环境内稳态并“肠-肝轴”减轻肝脏炎症,进而通过肝肾互作改善肾脏中线粒体功能,从而抑制丝裂原活化蛋白激酶信号通路和肾脏纤维化改善长期高脂饮食诱导的早期DN小鼠肾功能损伤。