第—部分肾纤维化诊断指标的人群研究目的:通过分析反映不同分期慢性肾脏疾病(Chronic kidney disease,CKD)患者肾纤维化严重程度的指标,利用组间差异比较、有序logistic回归分析、ROC曲线进一步筛选出反映肾纤维化严重程度且具有诊断价值的指标。对象与方法:利用山西省白求恩医院医生工作站和电子病历系统收集于2022年1月25日-2023年1月25日在该院住院的CKD患者。采用分层随机抽样的方法进行抽样,首先根据CKD的临床分期将CKD患者分为三组,1-2期为一组、3-4期为一组、5期为一组;再采用简单随机抽样法从每组CKD患者中抽取49人,共147人作为研究对象。收集患者性别、年龄、BUNRepSox半抑制浓度、Scr、尿酸、同型半胱氨酸、钠尿肽、尿β2微球蛋白、ALB、甘油三酯、TNF-α、IL-6、IFN-γ、RBP、Hs-CRP等15个指标。采用方差分析和卡方检验分析CKD不同分期的指标是否存在差异,采用有序logistic回归模型分析CKD与其相关诊断指标之间的关联关系,最后通过ROC曲线预测每组指标的诊断价值。结果:147名CKD患者中,男性在1-2期组、3-4期组和5期组占比最多,分别为63.27%、53.06%和61.22%,且5期组患者的年龄相较于1-2期与3-4期更大,最大年龄为(60.00±2.20)岁。年龄、BUN、Scr、尿酸、同型半胱氨酸、钠尿肽、ALB、TNF-α、IL-6、IFN-γ、RBP、Hs-CRP等12个指标在不同组间的差异均具有统计学意义(P<0.05)。有序logistic回归分析结果显示,高尿素(OR=1.323,95%CI:1.230,1.424)、高血肌酐(OR=1.019,95%CI:1.013,1.024)、高尿酸(OR=1.006,95%CI:1.628,4.795)、高同型半胱氨酸(OR=1.000,95%CI:1.628,4.795)、高钠尿肽(OR=1.002,95%CI:1.001,1.003)、高尿β2微球蛋白(OR=2.513,95%CI:1.856,3.403)、高 TNF-α(OR=7.102,95%CI:4.489,11.237)、高 IL-6(OR=1.237,95%CI:1.171,1.307)、高 IFN-γ(OR=9.477,95%CI:4.616,19.458)、高 RBP(OR=1.017,95%CI:1.008,1.026)、高 Hs-CRP(OR=1.019,95%CI:1.010,1.028)是CKD的严重程度的独立危险因素。ROC曲线分析中,1-2期组无指标对CKD有诊断价值(P<0.05,AUC<0.5);3-4期组同样无指标对CKD有诊断价值(P>0.05);5期组中,BUN、Scr、尿酸、钠尿肽、尿β2微球蛋白、TNF-α、IL-6、IFN-γ、RBP、Hs-CRP均对CKD有诊断价值(P<0.05,AUC>0.5)。结论:本研究表明BUN、Scr、尿酸、同型半胱氨酸、钠尿肽、尿β2微球蛋白、TNF-α、IL-6、IFN-γ、RBP和Hs-CRP的升高与CKD严重程度相关且是CKD独立危险因素。在1-2期组,3-4期组中无指标具有诊断价值,5期组中大部分指标(BUN、Scr、尿酸、钠尿肽、尿β2微球蛋白、TNF-α、IL-6、IFN-γ、RBP、Hs-CRP)具有诊断价值。由于CKD的进展通路是通过肾纤维化达成的,反映不同严重程度CKD的指标也与肾纤维化严重程度相关且可以作为肾纤维化的独立危险因素。虽筛选出肾纤维化独立危险因素的指标,但这些指标只针对5期患者具有诊断意义,且这些指标与肾纤维化之间的关联仍需要通过大量样本和不同分期的CKD的病理组织进一步验证,根据目前已有的样本,肾纤维化早期还未有指标具有诊断价值,目前对于肾纤维化在早期的诊断仍缺乏有效手段,综上,探索肾纤维化早期阶段的诊断方式有待进行更深一步的研究。第二部分 MNP-PEG-Mn探针的制备及体内外研究目的:本研究设计并且合成了一种水溶性良好、粒径约2.7 nm的MNP-PEG-Mn纳米颗粒,该探针可以对早期肾纤维化进行磁共振成像(MRI)和光声成像(PAI)的多模态活体诊断成像。方法:1.MNP-PEG-Mn的合成及表征①制备MNP纳米探针,用5000分子量的聚乙二醇对其进行表面修饰,随后与MnCl2水溶液搅拌反应,合成MNP-PEG-Mn;②使用透射电镜(TEM)观察探针形貌和粒径;使用DLS测定流体粒径以及电负性;使用紫外分光光度计测定其在UV-Vis-NIR的吸收;使用FT-IR红外光谱验证MNP与PEG正常连接;通过透析实验检查MNP-PEG-Mn中Mn2+连接的稳定性。2.体外性能评价①溶液层面:观察MNP-PEG-Mn的抗自由基能力;配制不同浓度的MNP-PEG-Mn做溶液的MRI和PAI;②细胞层面:用CCK-8观察不同浓度的MNP-PEG-Mn 与 NRK-52E 孵育 24 h 后细胞的存活率;MNP-PEG-Mn 与 NRK-52E孵育5 h,隔一小时观察流式检测标记率;使用共聚焦、细胞电镜分别间接和直接的观察MNP-PEG-Mn在细胞内的摄取和分布情况。3.体内性能评价分别对正常组、肾纤维化模型7天组、肾纤维化模型28天组进行光声和核磁的活体成像。收集每组给MNP-PEG-Mn前和给MNP-PEG-Mn后2 h、4 h、6 h、12 h和24 h的信号图像,并做定量分析。4.切片实验与血生化实验分别对正常组、7天肾纤维化组和28天肾纤维化组进行H&E和Masson染色、收集血肌酐与尿素氮,并对在纤维组织中高表达的α-SMA,CollagenⅠ和Fibronectin蛋白进行免疫组化分析各个组中的变化情况,与临床的生化检验与病理方法进行对比。5.MNP-PEG-Mn的安全性实验取注射MNP-PEG-Mn 24 h后和未注射MNP-PEG-Mn的正常小鼠的主要器官(心、肝、脾、肺、肾),以及收集两组小鼠的血肌酐、尿素氮、丙谷转氨酶和谷草转氨酶,用H&E进行组织学染色分析和生化分析,进一步证实MNP-PEG-Mn的生物安全性。结果:1.成功合成了探针MNP-PEG-Mn,透射电镜观察纳米探针表现为圆形且分布均匀;DLS测得MNP-PEG-Mn的流体粒径为2.7±2.2 nm,带负电荷;MNP-PEG-Mn的紫外光谱中显示在200-1000 nm范围内有吸收,随着波长逐渐递增,探针的光吸收呈斜坡状下降。黑色素的特征峰的位置是在3500 cm-1,PEG的特征峰是在500 cm-1。PEG修饰后的黑色素有两个峰,可以证明PEG成功地修饰到MNP表面。MNP-PEG-Mn在第一个2 h释放3%的Mn2+,2 h之后释放达到平台期,在随后的48 h小时内没有继续释放Mn2+。2.①溶液层面:MNP-PEG-Mn溶液的MR与PA信号强度均随探针浓度的增加呈线性递增,在1500 μg/mL时信号最强;②细胞层面:CCK-8结果表明,MNP-PEG-Mn与NRK-52E共孵育24 h后,medical anthropology探针浓度即使高达1500μg/mL,NRK-52E的存活率仍高达95%;流式细胞术对细胞鉴定结果为在孵育2 h时,NRK-52E对MNP-PEG-Mn的摄取已达到99%;激光共聚焦观察到在DAIpatasertib浓度PI所染的蓝色胞核周围胞质有携带FITC的MNP-PEG-Mn的绿色荧光存在;细胞TEM结果显示细胞质中存在黑色纳米粒。3.尾静脉注射MNP-PEG-Mn后,各个小组均在6 h达到信号最大值,其中7天组肾纤维化小鼠的光声与核磁信号最强,之后正常组在24 h时将MNP-PEG-Mn完全代谢,7天组肾纤维化小鼠与28天组肾纤维化小鼠肾脏内均有存留,但28天组小鼠的代谢曲线更加平缓。4.7天和28天组中可以清楚地看出,纤维化面积与正常组相比,在28天组时纤维化面积大于7天组的纤维化面积。同时血生化结果表明,与正常组相比,28天组小鼠尿素氮显著增加了大约2.74倍,血肌酐比正常组增加了大约2.32倍。免疫组化分析中显示与正常组相比,α-SMA,Collagen Ⅰ和Fibronectin明显升高。5.两组小鼠的所有主要器官组织结构均未见明显的病理改变、组织破坏或炎症浸润。另外,在收集的血肌酐、尿素氮、丙谷转氨酶和谷草转氨酶中,血清生化分析显示各指标没有明显变化。结论:本课题成功开发了一种新型超小黑色素MNP-PEG-Mn纳米平台,用于7天肾纤维化早期的诊断,可作为一种安全、无毒、生物相容性的PA/MRI双模成像诊断造影剂。获得的超小尺寸(≈2.7 nm)的MNP-PEG-Mn可以通过其正电荷效应和超小颗粒尺寸被动地靶向积累到肾脏中。正如所预期的那样,MNP-PEG-Mn显示7天肾纤维化组的PA和MRI信号远高于正常和28天静脉注射组,由于其良好的抗自由基能力,MNP不会进一步导致肾脏疾病的恶化。因此,超小颗粒尺寸的MNP-PEG-Mn为克服早期CKD的准确诊断提供了一种新型的纳米造影剂,具有良好的临床应用前景。