【目的c-Met抑制剂】胆管癌是一类起源于胆管内膜上皮细胞、具有高度侵袭性的恶性肿瘤。近些年来,胆管癌的发病率、死亡率在全球范围内呈逐渐上升的趋势。胆管癌起病症状隐匿,缺乏特异性诊断指标,诊断较为困难,结合其自身的生物学特点,一般预后极差。因此,目前迫切需要找到一些能实现早期诊断、有效个体化治疗的分子靶标和肿瘤标志物。本课题通过运用临床病理标本检测、体外细胞实验及体内动物实验来探究let-7b-5p与SDC2间的靶向关系以及探索let-7b-5p/SDC2轴在胆管癌增殖、迁移中的机制,为实现胆管癌的早期诊断、个体化治疗及监测预后复发提供新的方向和思路。【方法】1.收集整理临床患者手术切除胆管癌组织标本和癌旁胆管组织标本,应用FISH方法检测胆管癌及癌旁组织中let-7b-5p的表达,分析胆管癌及癌旁组织中let-7b-5p表达的差异;通过免疫组织化学染色分析胆管癌及癌旁组织中SDC2蛋白表达,并探讨let-7b-5p、SDC2的表达量与胆管癌患者临床病理特征之间的关系。2.选取人胆管癌细胞系Hucc T1,传代培养后选取第3代细胞作为研究对象。构建let-7b-5p慢病毒敲低、过表达载体和各自阴性对照载体,继而包装各组慢病毒后分别转入胆管癌Hucc T1细胞,设立未转染细胞为空白对照组,余转染细胞分别为let-7b-5p敲低阴性对照组、let-7b-5p敲低组、let-7b-5p过表达阴性对照组、let-7b-5p过表达组,采用荧光显微镜直接观察评价转染效率。细胞转染后48h应用q PCR方法检测5组细胞内let-7b-5p表达量的差异,评价转染效果。随后通过EDU、流式细胞技术、细胞划痕实验、细胞迁移实验及Transwell侵袭实验等分别检测各组细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的能力;使用Western blot检测各组增殖和凋亡相关因子Ki67、Caspase3的表达,以及各组细胞SDC2蛋白的表达,利用双荧光素酶基因检测系统明确let-7b-5p对SDC2的靶向调控性。3.选取BALB/c裸鼠作为研究对象,将上述各组胆管癌细胞行裸鼠皮下接种,构建皮下移植瘤模型。裸鼠饲养3周后,针对裸鼠生长状态和瘤体的生长趋势,进行数据分析和实验检测,探索let-7b-5p/SDC2轴在胆管癌病理发展中的作用机制。【结果】1.FISH检测let-7b-5p表达结果:胆管癌组织中的表达低于癌旁组织,对比差异显著(P<0.05);免疫组织化学检测SDC2蛋白表达结果:SDC2在胆管癌组织内表达明显上调,对比差异显著(P<0.05);let-7b-5p、SDC2的表达与临床病理学资料分析:胆管癌组织内let-7b-5p、SDC2的表达量与患者年龄、淋巴结转移情况、肿瘤分化程度、TNM分期均无显著相关性,差异均无统计学意义(P>0.05);人胆管癌组织内let-7b-5p的表达与SDC2的表达存在负相关性。2.细胞功能验证:(1)成功构建了慢病毒let-7b-5p敲低、过表达载体和各自阴性对照载体,并成功包装慢病毒,各组慢病毒稳定转染人胆管癌细胞;(2)q PCR检测各组细胞let-7b-5p表达结果:let-7b-5p敲低组明显下调并低于其余各组,差异显著(P<0.05);let-7b-5p过表达组明显上调并高于其余各组,差异显著(P<0.05);空白对照组、let-7b-5p敲低阴性对照组、let-7b-5p过表达阴性对照组,三组间比较,差异无统计学意义(P>0.05);(3)EDU检测各组细胞增殖活性:let-7b-5p敲低组增殖情况明显高于其它各组,对比差异显著(P<0.05),而let-7b-5p过表达组增殖情况明显低于其它各组,对比差异显著(P<0.05),其余三组间比较,差异无统计学意义(P>0.05);(4)流式细胞检测细胞凋亡性:let-7b-5p过表达组与过表达阴性对照组相比较,过表达组细胞凋亡率明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);let-7b-5p敲低组与敲低阴性对照组相比较,敲低组细胞凋亡率明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);let-7b-5p过表达组与空白对照组相比较,过表达组细胞凋亡率明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);let-7b-5p敲低组与空白对照组相比较,敲低组细胞凋亡率明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);(5)划痕实验检测各组细胞迁移能力:随着时间的推移,let-7b-5p敲低组细胞迁移能力明显高于其它各组,对比差异显著(P<0.05);let-7b-5p过表达组细胞迁移能力明显低于其它各组,对比差异显著(P<0.05);(6)Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力:let-7b-5p敲低组细胞迁移和侵袭能力明显高于其它各组,对比差异显著(P<0.05);let-7b-5p过表达组细胞迁移和侵袭能力明显低于其它各组,对比差异显著(P<0.05);(7)双荧光素酶基因检测结果表明let-7b-5p可直接与SDC2靶向结合;(8)Western blot检测各组SDC2的蛋白表达结果:let-7b-5p敲低组的SDC2的蛋白表达明显高于其它各组,对比差异显著(P<0.05);let-7b-5p过表达组的SDC2的蛋白表达明显低于其它各组,对比差异显著(P<0.05);(9)Western blot检测各组增殖和凋亡相关因子Ki67、Caspase3表达结果:let-7b-5p敲低组的Ki67的蛋白表达明显高于其它各组,对比差异显著(P<0.05);let-7b-5p过表达组的Ki67的蛋白表达明显低于其它各组,对比差异显著(P<0.05);let-7b-5p敲低组的Caspase3的蛋白表达明显低于其它各组,对比差异显著(P<0.05);let-7b-5p过表达组的Caspase3的蛋白表达明显高于其它各组,对比差异显著(P<0.05)。3.在肿瘤质量方面,let-7b-5p过表达组裸鼠的瘤体质量明显低于其余各组,对比差异显著(P<0.05);let-7b-5p敲低组裸鼠的瘤体质量明显高于其余各组,对比差异显著(P<0.05);敲低阴性对照组与过表达阴性对照组间无统计学差异。随着接种时间延长,各组裸鼠皮下移植瘤体积呈现增大趋势,let-7b-5p过表达组裸鼠的瘤体体积增长趋势明显低于其他各组,对比差异显著(P<0.05),let-7b-5p敲低组裸鼠瘤体体积增长趋势明显高于其他各组,对比差异显著(P<0.05),敲低阴性对照组与过表达阴性对照组间无明显统计学差异。过表达组裸鼠肿瘤组织中let-7b-5p的表达明显上调,且明显高于其他各组(P<0.05);敲低组裸鼠肿瘤组织中let-7b-5p的表达明显下调,且明显低于其他各组(P<0.05),敲低阴性对照组与过表达阴性对照组间无统计学差异。免疫组化检测裸鼠皮下移植瘤增殖、凋亡因子的结果表明,let-7b-5p过表达可以抑制瘤体癌细胞增殖,促进瘤体癌细胞凋亡。let-7b-5p敲低组裸鼠肿瘤组织中SDC2蛋白表达明显上调,且明显高于其他各组(P<0.05);let-7b-5p过表达组裸鼠肿瘤组织中SDC2蛋白表达明显下调,且明显低于其他各组(P<0.05),敲低阴性对照组与过表达阴性对照组间无统计学差异。【结论】1.胆管癌组织内,let-7b-Medical Resources5p呈现低表达,抑癌性明显,SDC2表现出高表达的趋势,具有促癌特性;let-7b-5p的表达与SDC2的表达具有一定的负相关性。2.在胆管癌发生发展过程中,let-7b-5p抑制靶点SDC2的活性,最终对胆管癌细胞的生物活性进行调控;lAG-221et-7b-5p在胆管癌细胞内过表达可抑制SDC2的活性,从而抑制胆管癌细胞的增殖、迁移以及侵袭性能,并促进胆管癌细胞的凋亡,最终抑制胆管癌的发展。3.在胆管癌病理发展过程中,let-7b-5p上调可抑制SDC2的表达活性,并充分抑制裸鼠皮下移植瘤的生长趋势,最终抑制了胆管癌的发展,为临床表观遗传学研究胆管癌的病理发展机制提供了新的探索路径。