目的:系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种累及全身多个系统、多脏器的复杂的自身免疫性疾病。狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)是SLE常见并发症。各种损伤因素导致的足细胞形态、功能和数目的异常均可引起LN蛋白尿的产生并最终导致肾功能损害。近来转录组学、蛋白组学及生物信息学研究发现含干扰素诱导解旋酶C域蛋白1(interferon induced with helicase C domain 1,IFIH1)编码的黑色素瘤分化相关基因5(melanoma-differentiation-shoulder pathologyassociated gene 5,MDA5),既是SLE也是LN的关键基因,而且MDA5蛋白表达增加与狼疮性肾炎的发生有关,然而其表达量增加的具体机制不明。三结构域蛋白38(tripartite motif-containing 38,TRIM38)是E3泛素连接酶TRIM家族成员之一,近来研究报道,TRIM38可以作为SUMO化的E3连接酶,调控底物蛋白MDA5,那么其是否在LN的发病中发挥作用呢?课题组前期采用生物信息学分析发现TRIM38蛋白在狼疮性肾炎患者肾组织中明显升高,预实验结果显示TRIM38蛋白在肾小球中主要定位于足细胞胞浆中,提示其可能与足细胞的损伤有关。本研究以LN患者的肾穿活检组织、Pristane诱导的狼疮模型小鼠和体外培养人足细胞(human podocytes,HPCs)为研究对象,探讨TRIM38通过调控MDA5在LN足细胞损伤中的作用及可能的机制,为进一步阐明LN的发病机制和药物研发提供新的思路。方法:1.选取LN患者肾穿活检组织标本为研究对象,作为狼疮性肾炎(LN)组。肾癌患者手术期间切除的癌旁远端组织并经病理诊断为正常的肾组织,作为对照(Control)组。采用HE、PAS染色观察肾组织的形态学变化;免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)检测肾小球中TRIM38、Nephrin的表达情况,分析TRIM38与足细胞损伤之间的关系。2.7周龄雌性BALB/c小鼠6只腹腔注射Pristane,作为狼疮性肾炎模型组,同周龄雌性BALB/c小鼠6只腹腔注射生理盐水,作为对照组。模型小鼠与对照小鼠于30周龄取材,取材前收集小鼠血液、尿液标本,取材时留取双侧肾脏组织。采用CBB法检测小鼠24 h尿蛋白水平,肌氨酸氧化酶法测小鼠血肌酐和尿肌酐水平,酶联免疫吸附法测定小鼠微量白蛋白水平;HE、PAS染色观察小鼠肾组织形态学变化;IHC检测肾小球Podocin、TRIM38和MDA5的表达水平;分析TRIM38及MDA5与肾损伤之间的关联并探讨TRIM38和MDA5之间的相关性。3.以人足细胞(HPCs)为研究对象,检测在LN环境下,TRIM38的表达及其对足细胞损伤的影响及机制。(1)狼疮性肾炎患者置换血浆(LN plasma)对足细胞损伤及TRIM38、MDA5 m RNA及蛋白表达水平的影响:10%LN plasma刺激HPCs 0 h、24h,采用western blot蛋白印迹检测足细胞标志物Podocin及TRIM38和MDA5的蛋白表达情况,采用Real-time PCR检测TRIM38和IFIH1的m RNA水平。(2)过表达TRIM38蛋白或是采用小干扰RNA敲低TRIM38对LN plasma诱导的足细胞损伤的影响:将HPCs随机分为空载质粒组(His-Vector)和过表达TRIM38质粒组(His-TRIM38),或敲低对照组(siRAD001 RNA-NC)和敲低TRIM38组(si RNA-TRIM38),转染质粒或是si RNA 24h后,给予10%LN plasma刺激HPCs细胞24 h,western blot方法检测Nephrin蛋白的表达。(3)TRIM38通过调控MDA5参与LN plasma诱导的HPCs细胞损伤的机制研究。a.Western blot方法检测过表达/敲低TRIM38对MDA5蛋白表达水平的影响。b.采用免疫共沉淀的方法检测TRIM38与MDA5是否存在结合。c.采用免疫共沉淀的方法检测血浆刺激前后MDA5 SUMO化(SUMO1)水平的变化。d.采用免疫共沉淀的方法检测过表达TRIM38对于MDA5 SUMO化(SUMO1)的影响。结果:1.TRIM38蛋白在LN肾小球足细胞中表达升高,且与肾功能受损有关(1)临床肾穿活检组织IHC结果显示,TRIM38蛋白的阳性信号主要定位于肾小球足细胞的胞浆中,且LN组中TRIM38蛋白较癌旁对照组表达升高。足细胞标志蛋白Nephrin蛋白较癌旁对照组表达降低。肾小球中TRIM38蛋白与Nephrin蛋白的表达呈负相关(r=-0.94,P<0.05)。(2)动物实验小鼠肾功能生化指标显示,与对照组BALB/c小鼠相比,Pristane诱导狼疮鼠24 h尿蛋白、血肌酐、u ACR的水平明显升高。HE、PAS染色观察小鼠肾组织形态学变化,结果显示,Pristane诱导的狼疮小鼠肾小球中细胞数目明显增加,系膜区增宽,基底膜增厚,基质沉积增加。IHC结果显示,TRIM38蛋白在小鼠肾小球足细胞,位于细胞胞浆中。与对照组小鼠相比,Pristane诱导的狼疮小鼠肾小球中TRIM38和MDA5蛋白明显增加;足细胞标志物Podocin在Pristane诱导的狼疮小鼠肾小球中明显降低。两组小鼠肾小球中TRIM38蛋白的表达与Podocin呈负相关(r=-0.51,P<0.05);与u ACR(r=0.58,P<0.05)、24h尿蛋白(r=0.77,P<0.05)、血肌酐(r=0.97,P<0.05)均呈正相关。两组小鼠肾小球中MDA5蛋白的表达与Podocin呈负相关(r=-0.44,P<0.05);与u ACR(r=0.69,P<0.05)、24h尿蛋白(r=0.84,P<0.05)、血肌酐(r=0.98,P<0.05)均呈正相关;而且MDA5蛋白的表达与TRIM38的表达也呈正相关(r=0.49,P<0.05)。2.TRIM38对LN plasma诱导的足细胞损伤的影响及机制(1)LN plasma对足细胞损伤及TRIM38、MDA5 m RNA及蛋白表达水平的影响。LN plasma刺激HPCs 24h后,Podocin蛋白表达明显降低,TRIM38和IFIH1的m RNA表达水平均无显著变化,而TRIM38和MDA5蛋白表达明显增加。(2)TRIM38对LN plasma诱导的足细胞损伤的影响。TRIM38在HPCs中过表达后,加重了LN plasma诱导的足细胞损伤,而HPCs中敲低TRIM38后,LN plasma诱导的足细胞损伤有所减轻。(3)TRIM38通过调控MDA5蛋白表达水平,参与了LN plasma诱导的HPCs细胞损伤。a.HPCs中过表达TRIM38后,MDA5蛋白的表达明显升高。HPCs中敲低TRIM38后,MDA5蛋白的表达水平明显降低。b.HPCs中TRIM38与MDA5存在结合。c.LN plasma刺激引起MDA5的SUMO化(SUMO1)水平升高。d.HPCs中过表达TRIM38后,MDA此网站5的SUMO化(SUMO1)水平明显增加。结论:TRIM38通过上调MDA5蛋白表达量,抑制足细胞裂孔膜蛋白的表达,介导了狼疮性肾炎中足细胞的损伤。