冬虫夏草是一种虫菌复合物,具有多种药理活性。作为名贵中草药,其具有独特的生长环境及生命周期,须经过低温诱导才能形成子实体。目前,低温对冬虫夏草生长发育的影响机制尚不清楚,研究资料缺乏。本论文以祁连山东麓高山草甸冬虫夏草单子囊孢子菌株TZ8-1为研究对象,常温培养(18℃,对照温度)和低温(-2℃和4℃)培养10天、30天、50天、70天后,利用光学显微镜观察菌落和菌丝形态、菌落鲜重和干重变化,以及分生孢子的发育情况;分析关键代谢物(如尿素、甘露醇、多酚和多糖)的积累变化;RNA-seq和基因表达差异技术挖掘冬虫夏草菌在低温(-2℃)胁迫下的响应基因,初步探索冬虫夏草菌菌丝在外观形态、生理生化和基因表达水平等多方面对低温的响应特征,为低温诱导冬虫夏草子实体发育提供理论基础。主要结果如下:1、低温培养过程中冬虫夏草菌菌丝形态有明显变化:菌落表面覆有绒毛状的气生菌丝,且伴有黄色菌丝带出现,菌丝膨大、变粗、扭结程度加深,分生孢子和气生菌丝的生长受到抑制,但色素沉积无明显变化。不同低温处理的冬虫夏草菌菌丝带出现的时间不同,菌丝扭结程度也不同。2、抗逆活性物质变化:-2℃和4℃处理后甘露醇含量呈先降低(49.69±1.02 mg/g,47.28±0.69 mg/g)后上升(93.43±0.77 mg/g,83.96±0.37 mg/g)的趋势;多糖含量呈先上升(14.29±0.58 mg/g,15.34±0.33 mg/g)后下降(8.07±0.40 mg/g,6.35±0.40 mg/g)的变化趋势;多酚含量在-2BAY 73-4506浓度℃处理后呈先上升(143.02±4.18mg/g)后下降(46.2±4.31 mg/g)的趋势,而经过4℃处理后显著下降(32.43±0.39 mg/g)趋势;尿素含量呈单峰响应特征,-2℃处理50天时达到峰值(22.28±0.60 mg/g),4℃处理30天时出现峰值(19.82±0.67mg/g),而在70天时尿素含量则都显著下降(9.23±0.48 mg/g,7.81±0.15 mg/g)。3、差异表达基因:T10-vs-CK组基因表达差异最小,共筛选到1887个显著差异表达的基因,T30-vs-CK组共筛选到3053个显著差异表达的基因,T50-vs-CK组共筛选到2289个显Biogenic resource著差异表达的基因,T70-vs-CK组基因表达差异最大,共筛选到3062个显著差异表达的基因。除了T10-vs-CK组上调基因数目多于下调基因数目,其余各组都是下调基因数目多于上调基因数目。4、差异功能基因参与物质代谢:低温处理冬虫夏草菌后发现了影响甘露醇、多糖、多酚和尿素等代谢通路的关键基因。低温处理后冬虫夏草菌中甘露醇的变化可能与甘露醇-1-磷酸5-脱氢酶(EC:1.1.1.17)等基因差异表达有关,多糖的变化可能与己糖激酶(EC:2.7.1.1)等基因差异表达有关,多酚变化可能与组氨醇磷酸氨基转移酶(EC:2.6.1VX-661体内实验剂量.9)等基因相关,而尿素含量的变化可能与尿素羧化酶(EC:6.3.4.6)等基因相关。q RT-PCR结果与转录组测序结果一致。综上,通过冬虫夏草菌对低温响应结果的分析,结果显示气生菌丝减少、菌丝变粗,扭结、生物量下降;关键代谢物甘露醇累积量增多,多糖、多酚和尿素含量下降;不同处理时间下差异表达基因数目不同,主要参与了甜菜碱生物合成、核糖体、酪氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等途径,初步揭示了冬虫夏草菌对低温生境的适应机制。