研究背景卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率在我国呈快速上升趋势。卵巢癌治疗难度大、预后差、死亡率高,而卵BYL719体内巢癌晚期的转移和侵袭是其高死亡率的主要原因之一。上皮-间充质转化(EMT)是上皮性的细胞由于外因刺激、内因决定等因素,逐步失去上皮细胞特性并获得间质细胞特性的过程。研究表明,EMT是肿瘤细胞转移浸润的初始步骤,是肿瘤侵袭过程中常常发生的一种重要的细胞生物学特征事件,在肿瘤的发生、发展、诊断及治疗等多方面均具有重要的研究价值。研究显示,EMT在卵巢癌的转移和侵袭过程中起到了重要的作用。经EMT后,上皮性卵巢癌(EOC)细胞的上皮细胞特性减弱,很多细胞获得了间质细胞的特性,从原发肿瘤上脱离的单个或多个成团细胞会随腹膜液自由流动,随后粘附于其他组织表面,向远处转移和组织深层浸润,形成局灶或大片转移,靶向EMT的药物研究已成为肿瘤药物研发的热点。近年来的研究表明,PKC家族蛋白在肿瘤的发生和恶化过程中发挥着重要作用,是肿瘤药物开发的潜在靶点。PKCε是由PRKCE基因编码的新型PKC家族的一员。PKCε已被证实在包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌等多种肿瘤中高表达,且与这些癌症的不良预后相关。这些研究主要集中在PKCε对于肿瘤发生、癌细胞增殖的促进作用等方面。迄今为止,零星的研究显示,PKCε可能与EMT有关联,可能能激活某些参与EMT的细胞内信号通路,参与肿瘤的EMT过程。鉴于EMT在卵巢癌迁移、侵润和耐药中的特殊意义,我们决定在上皮性卵巢癌中研究PKCε的作用,特别是其在卵巢癌EMT中的作用及相关机制,希望能为卵巢癌提供新的、可靠的、特异性治疗靶点,为卵巢癌的临床治疗提供新的思路。研究方法(1)利用生物信息数据分析平台进行检索分析,检索PRKCE基因在卵巢癌中的表达情况,分析其表达水平与卵巢癌的临床相关性。(2)收集本地卵巢癌患者的肿瘤组织及部分癌旁组织切片,通过免疫组化(IHC)实验检测PKCε表达情况;统计整理IHC评分和卵巢癌患者的临床病理信息,从而分析PKCε蛋白表达水平与本地卵巢癌患者的临床相关性。(3)通过免疫印迹(WB)实验检测PKCε蛋白在不同卵巢癌细胞株SKOV3、ES-2、3AO和A2780中的表达情况。(4)根据WB实验结果挑选合适的细胞系,利用si RNA逆转染敲减PRKCE基因、慢病毒感染过表达PRKCE基因、特异性抑制剂作用等手段对不同细胞系中的PRKCE进行敲减、过表达或抑制,考察PRKCE基因表达水平对卵巢癌细胞的细胞功能的影响,如细胞增殖(MTT)、细胞的EMT表型(如细胞伤痕愈合、transwell迁移和侵袭)等。(5)构建EMT生物标志物库用以筛选,对不同卵巢癌细胞中的PRKCE基因进行敲减或过表达,利用q RT-PCR实验进行筛选,筛选得到受PRKCE基因调控的EMT生物标志物;同时,利用WB实验进行发生显著变化的EMT生物标志物的验证。(6)运用细胞粘附实验,考察PRKCE基因对卵巢癌细胞粘附能力的调控。(7)综合运用WB、sh RNA慢病毒感染、transwell迁移和侵袭等实验技术,考察和验证PRKCE下游信号通路对卵巢癌EMT进程的调控。(8)构建卵巢癌细胞-小鼠卵巢原位成瘤模型,考察PRKCE基因表达对卵巢癌成瘤和肿瘤转移的影响。(9)运用IHC实验,验证PRKCE基因表达对小鼠卵巢癌肺转移模型和小鼠卵巢原位成瘤模型的肿瘤组织中的信号通路的调控。(10)利用生物信息数据分析平台进行检索分析,考察PRKCE信号通路核心分子在卵巢癌中的表达情况,分析其与卵巢癌临床的相关性。(11)通过IHC实验检测PRKCE信号通路核心分子的表达情况;统计整理IHC评分和卵巢癌患者的临床病理信息,从而分析其表达水平与本地卵巢癌患者的临床相关性。研究结果(1)PRKCE基因在TCGA、GEPIA等国际认可的数据库中的分析结果表明,其在上皮性卵巢癌中显著高表达。而Kaplan-Meier数据分析平台的结果表明,PRKCE基因在上皮性卵巢癌组织中的表达水平与卵巢癌患者的预后相关,其表达与总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)呈负相关关系。(2)PKCε蛋白的表达水平在本地区的卵巢癌患者中高表达,且与患者的癌症分期、分化等恶性程度密切相关,与患者年龄、组织学亚型等无显著相关性。(3)相比于正常卵巢上皮细胞,PKCε蛋白在多种卵巢癌细胞株中异常表达,且在多个卵巢癌细胞系中高表达。(4)在A2780和3AO细胞中过表达PRKCE基因,显著促进了卵巢癌细胞的EMT表型,促进了卵巢癌细胞的迁移和侵袭,对细胞增殖无显著影biopolymeric membrane响。而在SKOV3和ES-2细胞中敲减PRKCE基因,能够显著降低细胞的EMT表型,抑制了卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力,对细胞增殖无影响。PKCε多肽抑制剂也能显著降低卵巢癌细胞SKOV3和ES-2的EMT表型,即迁移和侵袭能力。(5)根据已发表的重要综述和经典文献,我们收集整理了16个与肿瘤细胞EMT进程密切相关的基因进行筛选和研究。对不同卵巢癌细胞SKOV3、ES-2、A2780和3AO中的PRKCE基因进行敲减或过表达后q RT-PCR实验筛选表明,PRKCE基因能够调控卵巢癌细胞中EMT生物标志分子SNAIL1,E-cadherin和Vimentin的m RNA表达。WB实验验证:PRKCE基因能够调控卵巢癌细胞中EMT生物标志分子SNAIL1,E-cadherin和Vimentin的蛋白表达。(6)在SKOV3和ES-2细胞中敲减PRKCE基因,能够显著抑制细胞的粘附能力;在A2780和3AO细胞中过表达PRKCE基因,能够显著增强卵巢癌细胞的粘附能力。(7)WB结果表明,PRKCE基因在卵巢癌细胞中调控Integrinβ1、ILK等蛋白的表达。Integrinβ1蛋白在多种卵巢癌细胞中表达。抑制Integrinβ1的表达显著抑制了卵巢癌细胞SKOV3和ES-2的EMT表型。PRKCE基因通过Integrinβ1-ILK-SNAIL1通路调控卵巢癌细胞EMT进程。(8)PRKCE基因过表达在裸鼠卵巢原位成瘤模型中会促进肿瘤发生转移。IHC实验结果表明,在裸鼠卵巢原位成瘤模型中,PRKCE基因过表达调控了肿瘤组织中Integrinβ1、SNAIL1、Vimentin和E-cadherin的蛋白表达。此外,在裸鼠卵巢癌肺转移模型中敲减PRKCE基因,也调控了肿瘤组织中的Integrinβ1、SNAIL1、Vimentin和E-cadherin的蛋白表达。(9)Integrinβ1基因与PRKCE和ILK在TCGA的卵巢癌数据库中表达正相关,其表达水平与卵巢癌患者的预后相关,表达越高,总生存期和无进展生存期越低。Integrinβ1蛋白的表达水平在本地区的卵巢癌患者组织中相较正常卵巢组织中表达较高,其表达水平与本地区的卵巢癌患者的癌症分期、恶性分化程度密切相关,与患者年龄、组织学亚型等无显著相关性。IDN-6556研究结论PRKCE基因与上皮性卵巢癌有紧密的临床相关性,其表达与上皮性卵巢癌组织患者的预后密切相关。PRKCE基因能够调控多种上皮性卵巢癌细胞的EMT表型及细胞粘附。PRKCE基因通过Integrinβ1-ILK-SNAIL1通路并最终由E-cadherin和Vimentin介导了卵巢癌的EMT进程。我们的研究结果将可能为卵巢癌提供新的、可靠的、特异性治疗靶点,为卵巢癌的临床治疗提供新思路。