针对晚期(复发)喉癌常用的治疗方法包括:放疗、化疗、同步放化疗、分子靶向治疗、免疫治疗及多种方法联合治疗,但是仍然效果较差,治疗有效率低。由于自噬与肿瘤免疫逃逸的相互调节是肿瘤恶性进展的内在因素之一,研究自噬与免疫检查点通路间的相互作用,通过对自噬和免疫检查点通路加以调控进而提高抗肿瘤疗效,是一个值得研究的方向。研究目的:筛选喉癌中自噬通路及免疫检查点通路中的差异基因并进行验证,初步探讨喉癌中自噬和免疫检查点通路间的作用机制。实验方法:(1)差异基因筛选:从TCGA数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)中下载了喉癌RNA-seq原始表达谱数据,并进行Spearman相关性分析,将筛选得到的相关性>0.5的基因进行差异分析后,选择以P<0.05,|log2(foldchange)|<1为阈值,即采用DESeq2方法筛选出三组差异基因。(2)质粒的制备:构建差异基因的RNAi干扰质粒载体及过表达载体,经测序分析,质粒序列与预设序列一致,测序结果为单一峰,质粒载体构建成功。(3)差异基因的细胞学验证:质粒载体构建成功后,包装成慢病毒分别感染喉癌细胞系TU686和AMC-HN-8细胞。分别以Western Blot,selleck HPLCReal-time PCR检测STAT1、TP53INP2、EGF基因的敲低效率,CCK-8检测细胞增殖活性,流式双标检测细胞凋亡,并将得到的数据进行灰度分析后,绘制条形图,最后筛选出靶基因。(4)探究TP53INP2-TICAM1-PDL1信号轴在自噬和PD-L1中的作用构建TP53INP2敲减质粒及TICAM1的过表达质粒,感染AMC-HN-8细胞,分别使用划痕实验、Transwell迁移实验、自噬激活剂雷帕霉素、Western Blot检测TP53INP2—TICAM1—PD-L1信号轴上的关键蛋白:TP53INP2、LC3AB、TICAM1、PD-L1这四种关键蛋白的相互影响。实验结果:(1)喉癌中自噬通路与PD-L1通路的三对差异基因分别为:TP53INP2-TICAM1、STAT1-CTSL、EGF-PRKAA2。(2)敲低STAT1后,喉癌细胞增殖水平显著降低,而凋亡水平显著增高,LC3及PD-L1蛋白水平明显降低。(3)敲低EGF后,喉癌细胞增殖水平显著降低,而凋亡水平显著增高,LC3及PD-L1蛋白水平明显降低。(4)敲低TP53INP2后,LC3-II/I、PD-L1蛋白表达水平明显降低,细胞增殖活性明显增加,而对于细胞凋亡水平的检测中,敲低TP53INP2后,TU686细胞的凋亡水平明显增加,而AMC-HN-8细胞的凋亡水平明显降低。(5)只有TP53INP2敲减慢病毒在两组细胞系的敲减效率验证中得到了两个满意的双靶点,敲减效率显著。最终选择TP53INP2-TICAM1作为研究的靶基因。(6)敲低TP53INP2后,TP53INP2、LC3AB、TICAM1蛋白表达明显下调,细胞增殖水平下降,迁移水平亦明显下降,但细胞增殖水平及迁移水平在使用自噬激活剂以后明显升高;敲低TICAM1后,PD-L1和LC3AB蛋白均表达下调,但当敲低TP53INP2的同时,TICAM1过表达时,LCnecrobiosis lipoidica3AB蛋白的表达明显上调,PD-L1表达上调,TP53INP2蛋白的变化每次实验结果有所不同。结论:(1)敲低STAT1后:喉癌细胞增殖水平显著降低,凋亡水平显著增高,LC3及PD-L1此网站蛋白水平明显降低。敲低EGF后:喉癌细胞增殖水平显著降低,凋亡水平显著增高,LC3及PD-L1蛋白表达水平明显降低。(2)敲低TP53INP2后:喉癌细胞增殖水平活性明显增加,凋亡水平均显著降低,LC3及PD-L1蛋白水平明显降低,但需要进一步的实验证实。(3)TP53INP2—TICAM1—PD-L1信号轴可能是喉癌中自噬与PD-L1网络间的作用机制之一,TP53INP2和TICAM1对自噬和PD-L1通路均具有正向调控作用,同时,TP53INP2可通过正向调控TICAM1进一步实现对自噬和PD-L1的调控,而自噬激活剂雷帕霉素可通过促进TP53INP2出核而上调自噬。