一、研究背景下腰痛(Low back pain,LBP)是骨骼肌肉系统最常见的临床症状。LBP严重影响患者生活质量并带来巨大的经济负担。尽管有大量资源用于下腰痛的诊断和治疗,但目前这一难题仍未得到有效解决。在导致LBP的各种因素中,椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration,IVDD)是最常见的。目前有较多关于IVDD病因、进展和治疗相关的研究,但是IVDD发生发展的分子机制仍有待深入研究。如果不能从根源上阻止或延缓VDD进展,IVDD患者将会发生严重的脊柱退变,并出现难以逆转的神经损害表现。因此,深入探究IVDD的分子机制对于寻找精准高效的防治措施和治疗靶点具有重要临床意义。IVDD与髓核细胞(Nucleus pulposus cells,NPCs)功能障碍有着密切关系。在各种致病因素作用下,NPCs衰老加速、凋亡增加,线粒体功能受损进而释放大量活性氧物质,导致髓核细胞功能和数量进一步受损composite hepatic events,使得NPCs合成分泌细胞外基质成分减少而降解细胞外基质成分的酶增多。最终,NPCs数量减少、功能减退,髓核组织的正常结构和功能遭受破坏。精氨酸酶(Arginase,Arg)是一种参与氨基酸代谢转变的酶类物质,能催化精氨酸分解,转变为鸟氨酸和尿素,而精氨酸酶II(Arginase II,Arg2)是精氨酸酶主要形式之一,主要在肝外组织中表达。Arg2在多种疾病中通过参与调控炎症反应和细胞死亡等发挥重要作用。此前,Arg2被证明通过上调软骨细胞细胞外基质降解酶PUN30119抑制剂的水平加速软骨基质破坏进而加剧骨关节炎。然而,目前尚未见Arg2在IVDD中的作用及相关机制研究。由于骨更多关节组织与椎间盘组织的生物学相似性,以及椎间盘退变过程与骨关节炎发生发展的众多共同点,所以,我们推测:Arg2的表达水平的异常可能参与与IVDD的发生发展有关。二、研究目的1.探究Arg2在退变髓核组织中的表达情况,揭示Arg2与椎间盘退变的相关性;2.探究Arg2对髓核细胞凋亡、衰老、氧化应激和退变的影响及其发挥作用的信号通路;3.在动物层面验证Arg2对椎间盘退变的影响。三、研究方法、结果和结论第一部分:Arg2与椎间盘退变相关性研究。方法:(1)根据脊柱磁共振T2加权像进行IVDD严重程度分级;(2)获取髓核组织;(3)利用免疫荧光方法检测不同退变级别髓核组织退变相关指标的表达水平;(4)通过免疫组化、Western Blot、RT-q PCR、ELISA等检测不同退变级别髓核组织中Arg2的表达水平;(5)提取原代髓核细胞,并从细胞形态学、生化标记物层面鉴定提取的原代髓核细胞;(6)利用IL-1β构建退变细胞模型并进行验证;(7)通过RTq PCR检测IL-1β处理的NPCs中Arg2的表达水平。结果:(1)对患者椎间盘组织进行Pfirrmann分级;(2)通过免疫组化、Western Blot和RT-q PCR等检测不同级别髓核组织中Arg2的表达水平,发现退变髓核中的Arg2水平明显升高,并且Arg2随IVDD严重程度增加而相应增高;(3)通过ELISA检测不同退变级别椎间盘来源髓核细胞中Arg2表达情况并进行Arg2水平与IVDD级别的相关性分析,发现Arg2表达水平与IVDD级别程度有较强的相关性;(4)成功提取原代人髓核细胞并利用IL-1β处理NPCs以构建退变模型;(5)退变的NPCs中Arg2表达水平显著升高。结论:本部分研究运用多种研究方法检测了不同级别IVDD中Arg2的表达水平,发现在退变椎间盘中Arg2表达水平升高。在利用IL-1β构建的原代人髓核细胞退变模型中,Arg2表达水平也显著升高。第二部分:Arg2对椎间盘髓核细胞的影响和调节机制研究。方法:(1)构建Arg2的si-RNA(si-Arg2)并通过si-RNA干扰Arg2的表达;(2)通过Western Blot、免疫荧光等检测si-Arg2对髓核细胞退变、衰老、凋亡和氧化应激等相关指标表达水平的影响;(3)构建Arg2过表达质粒,Arg2过表达后检测髓核细胞退变、衰老、凋亡和氧化应激等指标的变化;(4)使用NF-κB通路特异性阻断剂阻断NF-κB通路后,检测Arg2表达水平以及髓核细胞退变、衰老、凋亡和氧化应激等的变化。结果:(1)si-Arg2显著降低Arg2表达水平;(2)si-Arg2改善细胞外基质代谢并降低髓核细胞氧化应激、衰老和凋亡;(3)Arg2过表达加剧了IL-1β诱导的髓核细胞外基质代谢紊乱,并增加了髓核细胞氧化应激、衰老和凋亡;(4)NF-κB通路在Arg2过表达后被过度激活;(5)使用JSH-23特异性阻断NF-κB通路能改善髓核细胞外基质代谢,并减轻NPCs的氧化应激、衰老和凋亡。结论:本部分研究使用si-RNA和质粒过表达手段调控Arg2表达水平,揭示Arg2参与调控髓核细胞外基质代谢并影响髓核细胞氧化应激、衰老和凋亡。另外,Arg2能通过NF-κB通路调控髓核细胞外基质代谢并影响髓核细胞氧化应激、衰老和凋亡。第三部分:敲低Arg2对大鼠椎间盘退变的影响。方法:(1)构建椎间盘退变动物模型;(2)椎间盘内注射si-Arg2或对照试剂;(3)通过番红固绿染色检测椎间盘退变严重程度;(4)通过免疫组化检测椎间盘退变相关指标。结果:(1)成功构建椎间盘退变动物模型;(2)番红固绿染色结果提示si-Arg2显著增加了髓核组织含量;(3)免疫组织化学提示IVDD+si-Arg2组的II型胶原阳性细胞数量较IVDD组和IVDD+si NC组明显增加且MMP3阳性细胞数量显著减少。结论:本部分研究表明敲低Arg2显著改善了缓解了椎间盘退变,改善了细胞外基质代谢。小结本研究首次探索了Arg2在IVDD发生发展中的作用。通过免疫组化、Western Blot和RT-q PCR等检测手段发现,Arg2在IVDD中的表达水平升高;通过敲低和过表达技术调控Arg2表达,发现Arg2与基质代谢和NPCs氧化应激、衰老和凋亡等相关。NF-κB通路在Arg2过表达的髓核细胞中过度激活,而特异性阻断该通路则能改善Arg2过表达介导的髓核细胞氧化应激、衰老和凋亡。通过构建椎间盘退变动物模型,并使用si Arg2降低椎间盘中Arg2表达水平,减轻了IVDD程度。本研究揭示了Arg2通过NF-κB通路介导了椎间盘内氧化应激、衰老、凋亡和细胞外基质代谢紊乱控,而敲低Arg2则对IVDD发挥保护作用。