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油菜(Brassica napus)是世界上种植最广泛的油料作物,具有较高的经济价值。由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的油菜菌核病每年造成巨大经济损失,防治困难。挖掘和利用油菜抗核盘菌基因、创制抗病品种是绿色防控油菜菌核病的重要战略。FER(FERONIA)是一个多功能类受体激酶,既影响植物生长发育,又在植物免疫中发挥重要作用。但是目前FER在油菜对核盘菌的免疫中的功能及作用机制尚不甚了解。本研究分析了油菜FER1(Bn FER1)的抗核盘菌免疫功能和机制。获得的主要结果如下:(1)揭示了油菜FER1的抗核盘菌免疫功能。通过对Bn FER1超表达和RNAi(RNA interference)转基因植株的核盘菌接种分析和防卫反应检测分析,阐明了Bn FER1正调控油菜对核盘菌的抗性,促进胼胝质沉积和茉莉酸积累,但降低脱落酸和水杨酸积累。接种草酸缺失的核盘菌突变株oah1-3-6结果显示,Bn FER1不改变油菜对突变株oah1-3-6的抗性,抑制茉莉酸、脱落酸和水杨酸积累,并增强活性氧积累。表明Bn FER1介导产生对核盘菌的抗性是对核盘菌分泌草酸的响应,并且是促进茉莉酸合成的结果。Bn FER1超表达和RNAi植株接种核盘菌野生型和突变株oah1-3-6的蛋白组学分析结果显示,Bn FER1可能通过综合抑制超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)、抗坏血酸过氧化物酶(L-ascorbate peroxidase)和过氧化物酶(Peroxidase)等活性氧清除酶系提高活性氧积累。此外,对不同p H培养液水培45 d的Bn FER1转基因油菜的抗病性分析结果表明,碱性p H培Anti-epileptic medications养提高对核盘菌的抗性,Bn FER1为该抗性所必需,且受核盘菌草酸的诱导。以上结果暗示Bn FER1可能通过Captisol体外响应草酸带来的p H变化正调控油菜对核盘菌的抗性。(2)揭示了Bn FER1与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)蛋白Bn GAPA1、Bn GAPA2互作调控对核盘菌抗性的机制。明确了油菜GAPDH家族组成及其进化关系。通过酵母双杂、萤火素酶互补、分子荧光互补和免疫共沉淀分析证明了Bn FER1与Bn GAPA1、Bn GAPA2互作。烟草瞬时表达分析显示Bn FER1定位于细胞膜,Bn GProtein Tyrosine Kinase抑制剂APA1和Bn GAPA2定位在叶绿体,Bn FER1与Bn GAPA1、Bn GAPA2互作定位在细胞质膜、核膜以及与细胞质膜相邻的叶绿体上。四个油菜FER均与Bn GAPA1、Bn GAPA2互作。通过拟南芥T-DNA插入突变体gapa1和gapa2的抗病性分析,明确了At GAPA1和At GAPA2负调控对核盘菌的免疫和活性氧积累,但不影响对其草酸缺失突变株oah1-3-6的抗性。这些结果表明,作为对核盘菌草酸的响应,Bn FER1可能通过解除被Bn GAPA1、Bn GAPA2的互作和功能抑制激发对核盘菌的抗性。综上所述,本研究阐明了Bn FER1在油菜抗核盘菌免疫中的重要功能,揭示了基于Bn FER1与Bn GAPA1、Bn GAPA2互作的抗核盘菌调控机制,明确了针对核盘菌草酸的植物抗核盘菌分子机制,丰富了油菜与核盘菌之间的相互作用层次,提出了Bn FER1新的免疫途径,为油菜菌核病绿色防控以及抗病分子育种提供新策略和基因资源。

醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)超家族是一类活性依赖于NAD(P)~+的多功能酶蛋白,可催化内源性和外源性醛发生不可逆的氧化反应而转变为相应的酸,以保护机体免受醛类物质的毒害。在类胡萝卜代谢途径中,视黄醛脱氢酶(RALDH)是催化视黄醛不可逆氧化合成视黄酸的关键酶。昆虫ALDH基因家族的功能仅果蝇中有少许研究报道,尤其是其是否参与视黄酸信号途径未见研究报道。为验证家蚕ALDH基因家族在类胡萝卜素代谢途径中的功能,本研究首先对家蚕基因组中的ALDH同源基因进行了分析、鉴定Belumosudil供应商和分类,然后选取RALDH同源基因BmALDH1A1、BmALDH1A2、BmALDH1A3和BmALDH1A4进行了表达模式的检测,进一步构建表达载体,通过诱导表达、蛋白纯化获得有活性的酶蛋白,对BmALDH1A2酶蛋白的酶促活性进行检测,并通过定点突变技术确定影响活性的关键氨基酸位点,最后在细胞水平检测了BmALDH1A2和BmALDH1A4蛋白的亚细胞定位情况。主要研究结果如下:1.家蚕ALDH同源基因的鉴定及分析通过生物信息学分析在家蚕基因组中共鉴定出12个ALDH同源基因,预测编码18种蛋白质,均含有醛脱氢酶蛋白家族特有的Aldedh结构域。其中,与人类视Y-27632供应商黄醛脱氢酶RALDH同源的有四个基因,分别命名为BmALDH1A1、BmALDH1A2、BmALDH1A3和BmALDH1A4,均含有11个外显子。Medial plating四种RALDH同源蛋白的序列相似性达55%以上,且其二级结构和三级结构也非常相似。在后续的克隆测序中鉴定出BmALDH1A1基因存在8种不同的m RNA剪切形式,推测编码8种不同的蛋白质。2.家蚕RALDH同源基因(BmALDH1A1、BmALDH1A2和BmALDH1A4基因)的时空表达模式检测通过RT-PCR对家蚕RALDH同源基因在家蚕大造品系的时空表达模式进行了检测,结果显示,在家蚕的整个发育时期中BmALDH1A1基因的表达量均低于BmALDH1A2和BmALDH1A4基因的表达量。BmALDH1A1、BmALDH1A2和BmALDH1A4基因在胚胎期中的表达量均呈现先增加后降低的趋势;BmALDH1A1和BmALDH1A2基因在眠蚕中的表达量均低于对应起蚕中的表达量;BmALDH1A2基因在雌蛹、蛾中的表达量普遍高于雄蛹、蛾中的表达量,而BmALDH1A4基因的表达没有明显的雌雄差异。在家蚕五龄三天幼虫不同组织中,BmALDH1A1、BmALDH1A2和BmALDH1A4基因的表达情况各不相同,BmALDH1A1基因在体壁和精巢中有高量表达,BmALDH1A2基因在中肠中表达量最高,BmALDH1A4基因在精巢中表达量最高。综上所述,家蚕RALDH同源基因的表达存在组织和时期特异性。3.BmALDH1A2和BmALDH1A4蛋白的亚细胞免疫荧光定位利用制备的多克隆抗体研究家蚕BmALDH1A2和BmALDH1A4蛋白在家蚕卵巢细胞中的定位情况,结果显示,BmALDH1A2蛋白定位于线粒体中,而BmALDH1A4蛋白位于细胞质中。4.BmALDH1A2蛋白的酶活性研究通过酶活力实验将BmALDH1A2蛋白进行体外酶促反应的时间确定为30min,反应温度为30℃,最佳pH为7.5以及体系中包含的蛋白量确定为0.125 mg。对BmALDH1A2蛋白进行体外酶促反应后通过HPLC检测其反应产物,结果表明0.125 mg的BmALDH1A2蛋白可以在辅因子NAD~+存在的条件下将终浓度为10μM的全反式视黄醛(atRAL)完全转化为全反式视黄酸(atRA)。5.BmALDH1A2基因的定点突变与突变型BmALDH1A2蛋白的酶活性研究为了研究BmALDH1A2蛋白氨基酸序列的保守性,通过定点突变技术对在催化和辅酶结合中具有重要作用的三个氨基酸残基Glu182、Glu255和Cys289进行突变,并分别构建突变型BmALDH1A2表达载体,将其转化入BL21菌株中进行诱导表达和蛋白纯化,成功获得三种突变型BmALDH1A2蛋白,分别命名为BmALDH1A2~(E182S)、BmALDH1A2~(E255A)和BmALDH1A2~(C289S)。通过酶活力实验初步确定了突变型蛋白BmALDH1A2~(E182S)的酶活性与野生型蛋白BmALDH1A2基本一致,而突变型蛋白BmALDH1A2~(E255A)和BmALDH1A2~(C289S)完全丧失酶活性。对突变型BmALDH1A2蛋白进行体外酶促反应后通过HPLC检测其反应产物,结果再次表明突变型蛋白BmALDH1A2~(E255A)和BmALDH1A2~(C289S)功能完全丧失而突变型蛋白BmALDH1A2~(E182S)与野生型蛋白BmALDH1A2的功能一样,可以在辅因子NAD~+存在的条件下将atRAL转化为atRA。

苹果蠹蛾Cydia pomonella是我国重要的检疫性入侵害虫,对入侵地的苹果、梨等水果产业构成了严重威胁。滞育是苹果蠹蛾对环境的一种重要的适应性策略,不仅影响苹果蠹蛾在冬季的生存,还有助于同步种群动态,直接影响苹果蠹蛾在莅年的危害,但目前对苹果蠹蛾滞育机制的研究还有待深入。本研究以苹果蠹蛾的短日照诱导滞育现象为切入点,利用转录组和代谢组学,分析滞育前期的功能基因和代谢物的变化,通过差异基因筛选得到滞育诱导调控的关键基因,结合激素处理对目的基因功能进行初步研究,探究内分泌激素调控苹果蠹蛾滞育前期的分子机制,主要结果如下:1.确定了差异表达关键家族基因。转录组鉴定得到差异显著基因共648个,其中44个上调表达,604个下调表达;神经系统调节、物质和能量代谢以及内分泌系统在苹果蠹蛾滞育前期中发挥了重要作用;结合Adavosertib使用方法文献从转录组数据中筛选苹果蠹蛾滞育诱导中的关键基因,并对这些基因进行定量验证:蜕皮激素作用通路基因:受体Ec R、响应基因E75和HR3整体下调表达;保幼激素合成通路基因FPPS的表达在预蛹阶段显著上升;不同类型小热激蛋白在幼虫不同发育阶段表达各有差异,在5龄阶段HSP19.5、HSP21.5b、HSP24.3上调表达,在预蛹期HSP19.5、HSP21.5b、HSP24.3、HSP22.0、HSP22.1都显著下调。2.确定了差异表达的代谢物质。代谢组鉴定得到的代谢物共1397个,有223个代谢物差异显著,其中128个代谢物含量上升,95个代谢物含量下降;差异代谢物的丰度随着滞育诱导时间的增加而增加;能量代谢中NAD+、FMN和谷Ceralasertib氨酰胺,脂质代谢中二十碳五烯酸、硬脂酸、油酸、棕榈酸及碳水化合物代谢中乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖酸内酯、核酸糖、α-酮戊二酸等物质在幼虫不同发育阶段的含量存在显著差异,这些物质与苹果蠹蛾滞育前期的能量代谢、物质储备及耐寒性密切相关;且不同龄期差异代谢物富集到的通路有较大差异。因此,代谢组结果表明,苹果蠹蛾滞育前期的物质组成是一个动态的变化过程,随着滞育诱导时间的增加,诱导因素被不断感知和积累,最终启动滞育的开关。3.明确了滞育前期苹果蠹蛾幼虫通过减弱蜕皮激素作用途径和增强保幼激素合成维持体内低水平的蜕皮激素从而进入滞育。在滞育诱导条件下,幼虫体内蜕皮激素滴度显著低于正常发育的幼虫seleniranium intermediate,蜕皮激素作用通路基因Ec R、E75和HR3的表达显著低于正常发育的幼虫,保幼激素合成关键酶FPPS的表达在预蛹阶段显著上调;JHA可以提高幼虫体内保幼激素水平,并对蜕皮激素作用途径进行抑制,下调Ec R、E75和HR3的表达,从而诱导幼虫出现滞育的现象。综上所述,苹果蠹蛾在滞育诱导下与正常发育幼虫各个龄期的基因表达水平和代谢物种类及含量存在显著差异,随着诱导时间的增加,其体内差异基因数量减少,差异代谢物的数量逐渐增多;明确了滞育前期苹果蠹蛾幼虫通过减弱蜕皮激素作用途径和增强保幼激素合成维持体内低水平的蜕皮激素从而进入滞育,并推测神经系统调节、物质和能量代谢以及内分泌系统在苹果蠹蛾滞育前期中发挥了重要作用。

酪醇及其衍生物是一种来源于橄榄的酚类植物化学物质,其中酪醇和羟基酪醇具有天然的抗氧化特性,因此在商业上备受关注,被广泛应用于功能性食品成分和营养保健品中。近年来,针对酪醇和羟基酪醇的微生物合成研究越来越多。本实验室在前期的研究中,构建了一系列酪醇和羟基酪醇的微生物合成菌株。在羟基酪醇合成菌株YMGRD1H1中,羟化酶Hpa BC未能将酪醇完全转化。羟化酶Hpa BC和苯丙酮酸脱羧酶ARO10作为代谢途径中的关键酶尚未进行改造,其催化效率有待进一步提高。因此,本研究基于这些菌株,结合代谢工程、酶的定向进化及半理性改造策略旨在获得高产酪醇和羟基酪醇的菌株。主要研究结果如下:(1)采用蛋白质工程策略对合成羟基酪醇的关键酶Hpa B进行定向进化及筛选,构建全细胞催化剂。通过高通量筛选工作站及羟基酪醇-高碘酸钠显色反应对羟化酶Hpa B突变体库进行筛选,在30～70 mmol·L~(-1)浓度范围内梯度添加底物发酵结果显示YMG5A*R-Hpa B~(TLEH)C菌株在添加50 mmol·L~(-1)酪醇条件下羟基酪醇产量达48.2mmol·LThyroid toxicosis~(-1)(7.43 g·L~(-1)),相较于野生型催化效率提高了一倍。对底盘细胞和表达载体优化获得重组菌株BL21(DE3)p KK223-Hpa B~(TLEH)C,在添加60 mmol·L~(-1)酪醇条件下羟基酪醇的摇瓶产量达59.8 mmol·L~(-1)(9.22 g·L~(-1))。(2)基于代谢工程构建双途径合成羟基酪醇的重组菌株。根据文献在羟基酪醇生产菌株YMNSC 127716采购GRD1H1中表达外源的酪胺氧化酶(TYO)和酪氨酸脱羧酶(DDC),发酵结果显示羟基酪醇产量得到提高,菌株YMGRD1H1 p KK223-TYO-DDC羟基酪醇产量最高可达2.08 g·L~(-1),相较于菌株YMGRD1H1 1.81 g·L~(-1)提高了14.9%。(3)基于计算机模拟策略对合成酪醇的关键酶ARO10进行半理性设计及筛选,构建酪醇高产菌株。首先,基于计算机模拟分析苯丙酮酸脱羧酶ARO10底物结合位点,构建ARO10热点饱和突变GSK J4半抑制浓度体库,建立显色快速筛选方法,筛选高产酪醇突变株。最后,成功获得了三株ARO10突变后酪醇产量提高的重组菌株YMGR p KK223-ARO10~(D331S),YMGR p KK223-ARO10~(D331V)和YMGR p KK223-ARO10~(D331C),酪醇产量分别为1.91 g·L~(-1),2.02 g·L~(-1),2.04 g·L~(-1),相较于野生型的1.34 g·L~(-1)分别提高了42.5%,50.7%,52.2%。通过采用蛋白质工程和代谢工程策略,提高了羟化酶Hpa BC和苯丙酮酸脱羧酶ARO10的转化效率,获取了一系列突变体和菌株,为进一步构建具有工业应用潜力的羟基酪醇细胞工厂奠定了基础。

目的:真菌性角膜炎具有高致盲危险,其诊断和治疗仍有巨大挑战性。传统滴眼液给药通常由于眼固有屏障限制药物吸收、泪液周转等药物去除机制引发药物浓度迅速降低以及药物的不受控制释放引起的副作用等原因导致治疗效果不佳。研究表明活性氧(Reactive oxygen species,ROS)诱导的氧化应激和炎症是角膜组织坏死的主要原因,减少ROS和炎症反应是开发真菌性角膜炎药物的重要目标。因此,本研究拟构建一种双亲性ROS响应性可控释放纳米载药滴眼液以提高抗真菌药物伏立康唑(Voriconazole,VOR)的角膜渗透性和生物利用度,并增强其对真菌性角膜炎的治疗作用。方法:(1)乙二醇壳聚糖-苯硼酸酯纳米载药系统(GC-EB-VOR)的制备和表征:将苯硼酸酯(4-carboxyphenylboronic acid pinacolate,EB)与乙二醇壳聚糖(Glycol chitosan,GC)共价结合形成ROS响应性纳米载体(GC-EB),通过包载VOR自组装形成双亲性ROS响应性载药系统。采用透射电镜(Transmission MRTX1133体内electrPuromycin化学结构on microscopy,TEM)、动态光散射(Dynamic light scattering,DLS)和热重分析(Thewildlife medicinermogravimetric analysis,TGA)等表征方式测定GC-EB-VOR纳米药物的形貌、电位、官能团性质和热稳定性。(2)GC-EB-VOR纳米药物的ROS响应可控释放性分析:采用高效液相色谱(High-performance liquid chromatography,HPLC)测量药物的包载率、载药量并分析ROS响应后药物累计释放率。TEM观察ROS响应后GC-EB-VOR纳米药物的形态。(3)GC-EB-VOR纳米药物的生物安全性、抗炎及抗菌效果分析:采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法进行生物安全性评价。细胞摄取实验及溶酶体荧光染色分析纳米药物细胞内分布状况。DCFH-DA荧光探针法检测细胞内GC-EB-VOR对ROS的响应和清除。蛋白免疫印迹(Western blot)试验和实时荧光定量PCR(Realtime PCR)分析纳米药物干预后细胞内炎症因子表达水平。吸光度测定和平板计数实验探究纳米药物对真菌的抑制作用。(4)真菌性角膜炎小鼠模型构建及GC-EB-VOR的干预效果评价:标准镰刀菌菌株感染C57BL/6J小鼠建立真菌性角膜炎模型,纳米药物滴眼干预后,每两天采用裂隙灯拍照观察各组感染情况,临床评分法评估角膜炎症程度。HE染色评价角膜组织学变化。酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法探究角膜中TNF-α、IL-6、IL-1β的表达水平。DHE免疫荧光染色分析纳米药物处理后角膜内ROS的含量。结果:(1)本研究成功构建了双亲性的ROS响应性GC-EB-VOR纳米载药系统,TEM观察到GC-EB-VOR呈均匀球形,DLS测得Zeta电位呈正电位有利于纳米药物和细胞膜的结合而提高纳米药物的角膜渗透。TGA分析揭示了纳米药物良好的热稳定性。(2)该纳米载药体系的包封率约为96%,载药量达77%,响应ROS的能力具有明显的浓度依赖性,在低ROS浓度刺激下1小时内药物累计释放量占释放总量的大部分。(3)生物安全性评价表明GC-EB-VOR处理后细胞活力仍维持在80%以上,纳米药物能被人角膜上皮细胞(Human corneal epithelial cells,HCECs)有效摄取并通过溶酶体途径运输。DCFH-DA荧光强度随药物剂量逐渐增加而降低揭示了GC-EBVOR良好的响应并清除ROS的效应。Western blot和Real-time PCR实验表明GCEB-VOR干预后显著降低炎症因子水平。吸光度测定和平板计数实验结果显示GCEB-VOR处理组对常见致病菌(镰刀菌和烟曲霉菌)都有明显的抑制作用。(4)小鼠镰刀菌感染5天后,裂隙灯拍照观察到GC-EB-VOR处理组与PBS处理组相比角膜炎症反应明显减轻,临床评分显著降低。HE染色各组炎症程度与裂隙灯拍照结果一致。ELISA结果表明炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达显著降低。DHE免疫荧光染色显示出GC-EB-VOR组相较于PBS对照组有最低的荧光表达。结论:上述研究结果表明我们所研制的双亲性GC-EB-VOR纳米载药滴眼液具有高角膜穿透性和良好的角膜滞留性,在低浓度ROS下实现药物的可控释放,高效响应和消除ROS并抑制炎症反应,最终达到良好的抗真菌效果,为开发纳米药物以提高滴眼液对真菌性角膜炎的治疗效果,降低失明风险提供了新策略。

光动力治疗(Photodynahttps://www.selleck.cn/products/Staurosporine.htmlmic therapy,PDT)利用光敏剂在光照后与氧气等分子反应生成活性氧物质,进而杀死肿瘤细胞。与传统治疗方法相比,PDT具有副作用小、机体耐药性小等优点,是近年来备受关注的癌症治疗手段。然而目前PDT存在以下问题,严重制约其实际应用:(1)由于肿瘤的多样性、异质性和复发性,单一的PDT治疗效果普遍较差;(2)现有光动力治疗平台激发光波长较短(大多位于可见光区或近红外一区),难以有效穿透生物组织。将PDT与化疗结合构建联合治疗平台,是提高肿瘤治疗效果的有效手段;同时,由于光散射作用随波长增大而降低,将激发光红移至NIR-Ⅱb(1500-1700 nm)可有效提高组织穿透深度,到达深层肿瘤组织。因此,开发NIR-Ⅱb光动力/化疗联合治疗平台是攻克肿瘤治疗难题的重要思路。稀土纳米颗粒(RENPsdigenetic trematodes)具有Stokes/反-Stokes位移大、发射峰多等特性,可在连续吸收多个NIR-Ⅱb光子后发射位于可见光区域的上转换荧光(UCL),进而可激活光敏剂产生ROS,是开发NIR-Ⅱb光动力治疗平台的理想材料。同时,RENPs能在近红外光激发下产生位于NIR-Ⅱb的下转换荧光(DCL),可实时监测药物富集状况,辅助肿瘤治疗。基于此,本论文将RENPs与PDT光敏剂及可由肿瘤微环境刺激释放的化疗药物结合,开发了NIR-Ⅱb及肿瘤微环境激活的联合治疗平台。具体内容如下:本文基于Er~(3+)的NIR-Ⅱb激发及上转换发光性能设计合成了NaEr F_4@NaYF_4结构的RENPs,通过掺杂Tm~(3+)及调控其壳层厚度使UCL强度增强10倍以上。采用与两亲聚合物DSPE-PEG-FA自组装提升RENPs在水溶液中的分散性能,并通过疏水-疏水相互作用实现与光敏剂Ce6及化疗药物阿霉素(DOX)的结合。该纳米材料可以在1550 nm光照射下成功激活Ce6产生高细胞毒性的ROS;另外,DOX的氨基可在肿瘤此网站酸性微环境下发生质子化,导致其疏水性大大降低,进而在肿瘤部位释放。同时,叶酸(FA)可与肿瘤表面过表达的叶酸受体结合,使材料具有靶向肿瘤部位的能力。体外和体内治疗结果证明,本文所构建的联合治疗平台可成功杀死肿瘤细胞,抑制肿瘤生长,有望成为癌症治疗的有力工具。

以天然产物为先导的结构优化是绿色新农药创制的主要途径和重点。γ-丁内酯是一种含氧五元杂环化合物,广泛存在于活性天然产物和药物分子中,具有丰富多样的生物活性,是药物研发的优势结构。Nicotlactone A是从烟草中分离得到的降木脂素类化合物,具有较高的抗烟草花叶病毒活性。本论文以nicotlactone A为研究对象,首先对其高效合成进行了研究,然后以nicotlactone A及其中间体为先导,通过结构简化、骨架跃迁、开环和活性拼接等策略设计合成了四个系列(I–IV)167个含γ-丁内酯结构衍生物,并采用~1H NMR、~(13)C NMR和HRMS对目标化合物进行了结构表征。生物活性测定表明,α-羟基-γ-丁内酯类衍生物II和α-亚甲基-γ-丁内酯结构苄基醚类衍生物III具有优异的抗病毒活性,同时利用透射电镜、等温热滴定和分子对接等手段研究了高活性化合物的抗植物病毒作用机理;此外,含α-亚甲基-γ-丁内酯结构水杨醛类衍生物IV表现出显著的抑菌活性,进一步对高活性化合物进行了初步的抑菌作用机制研究。主要研究结果如下:(1)以丙烯酸甲酯为原料,通过Morita-Baylis-Hillman、乙酰化、硼酸酯化、In(OTf)_3催化关环、Mukaiyama水合等5步反应获得了天然产物(±)-nicotlactone A的推测结构。同时,基于开发的合成策略,设计合成了30个nicotlactone A的类似物(含I-a系列和I-b系列)。生物活性研究表明,8位去甲基化产物I-b1在500μg/m L浓度下对烟草花叶病毒(TMV)的钝化活性(72.8%)、治疗活性(40.2%)及保护活性(60.3%),与(±)-nicotlactone A活性相当。同时,构效关系研究表明,苯环上给电Talazoparib体内实验剂量子基团(烷氧基)有利于此类化合物的抗TMV活性,且γ-丁内酯环上8位甲基对此类化合物抗TMV活性影响较小,这为后续以化合物I-b1(L_2)为先导化合物的进一步结构优化提供了参考;(2)以Aβ pathology抗病毒活性化合物I-b1(L_2)为先导,应用骨架跃迁策略,设计合成21个α-羟基-γ-丁内酯类II系列化合物,并测定了它们对TMV的钝化活性、保护活性和治疗活性。结果表明,II-b15表现出较好的抗TMV钝化活性(EC_(50)=226.2μg/m L),与先导化合物I-b1(EC_(50)=228.8μg/m L)相当;化合物II-b12表现出最好的保护活性(EC_(50)=382.3μg/m L),与先导化合物I-b1(EC_(50)=384.6μg/m L)相当;(3)以具有一定抗病毒和抗真菌活性、且易合成的中间体L_3为先导化合物,通过开环策略,设计合成61个α-亚甲基-γ-丁内酯苄基醚类衍生物III-a–c,并对其抗病毒和抑菌活性进行了评价。生物活性测定表明,许多目标化合物对TMV具有良好的抗病毒活性,其中化合物III-b1表现出最好的抗TMV活性,在500μg/m L浓度下,其钝化活性、保护活性和治疗活性分别为88.9%、65.8%和52.8%,明显优于商业抗病毒剂病毒唑和宁南霉素。初步的抗病毒作用机制研究表明,化合物III-b1可以破坏病毒颗粒的完整性,与TMV外壳蛋白表现出较强的结合能力(K_d=3.06μM),由此推测TMV外壳蛋白可能为活性化合物III-b1的潜在作用靶标。此外,抑菌活性测定表明,化合物III-c16表现出较好且相对广谱的抑菌活性,其在50μg/m L浓度下对苹果树腐烂病菌抑制率达到100%,对小麦赤霉病菌抑制率达到89.5%;(4)基于水杨醛结构III-c系列化合物良好的抗病毒、抑菌活性,为了系统探讨其构效关系,进一步设计合成了55个含RP56976半抑制浓度α-亚甲基-γ-丁内酯结构的水杨醛类衍生物IV-a–c,并对其抗病毒、抑菌活性进行了评价。生物测定研究表明,部分化合物表现出一定的抗病毒活性,而抑菌活性突出。目标化合物对苹果树腐烂病菌、水稻纹枯病菌和辣椒疫霉病菌等植物病原真菌和卵菌具有广谱的体外抑菌活性。其中,化合物IV-c3对水稻纹枯病菌表现出优异的抑菌活性,其EC_(50)值为0.65μg/m L,优于阳性对照吡唑醚菌酯(EC_(50)=1.44μg/m L),且与多菌灵(EC_(50)=0.33μg/m L)相当。此外,化合物IV-c3在100μg/m L浓度下对水稻纹枯病具有良好的体内保护活性(84.1%),优于吡唑醚菌酯(78.4%)。盆栽实验表明,化合物IV-c3在200μg/m L浓度下对水稻纹枯病有74.8%的保护作用,与井冈霉素(78.2%)相当。抑菌作用机理研究表明,化合物IV-c3可以改变菌丝体形态、增加细胞膜通透性、降低呼吸代谢,并能有效抑制水稻纹枯病菌核的萌发和形成,从而有效控制病害。综上所述,本研究开发了降木脂素类化合物nicotlactone A的简洁全合成路线,并对其抗烟草花叶病毒构效关系进行了研究,同时,基于nicotlactone A先导骨架,我们发掘了多个具有较高抗植物病毒活性和抑菌活性的γ-丁内酯类先导化合物/候选化合物,这对新型杀菌剂/抗病毒剂的创制和植物病害的有效防治具有重要意义。

胃癌是一种异质性和侵袭性极高的恶性肿瘤，在全球范围内其发病率居第5位，死亡率居第3位。多数患者确诊时已处于进展期，预后极差。全身治疗是目前晚期胃癌最主要的治疗方式，人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)是HER2阳性胃癌的重要治疗靶点。随着HER2靶向药物和治疗方式的不断优化，一些胃癌患者已从中获益。但是耐药发生率高、不良反应严重仍是限制HER2靶向药物应用的瓶颈。因此，开发新型抗肿瘤药物对改善HER2阳性胃癌患者的长期生存具有重要意义。抗体药物偶联物（antibody drug conjugate,ADC）是一类新型、高效的抗肿瘤药物，由特异性靶向单克隆抗体、化学接头和小分子细胞毒性有效载荷组成，强大的治疗效果和适度的组织毒性是其主要优势。近年来，ADC在HER2阳性晚期胃癌的靶向治疗领域进展颇丰。首先，经过多年发展，包括DS-8201、RC48等在内的多种ADC已用于胃癌的二线及后线治疗。其次，随着ADC生物工程技术的进步，包括高药物抗体比例、可切割型连接子、能引发旁观者效应的毒性载荷等，使新型ADC能够在针对特定靶点肿瘤的治疗中发挥更为显著的治疗效果，其中一些ADC还具备多靶向性，能针对多个特异性靶点发挥抗癌功效。同时，ADC的研发已到达第三阶段，新一selleckchem代ADC通过位点特异性偶联技术，其均质单一性更高，细胞毒性载荷更高效，精准度更高，非靶向毒性作用更低。此外，ADC和免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor,ICI）组成的“靶免联合”治疗可能是晚期胃癌一种有前景的治疗策略。本文就靶向治疗时代ADCCL 318952 IC50在HER2阳性晚期胃癌患者中的应用和最新研究进展进行综述，并讨论ADC联合ICI在HER2阳性晚期胃癌中的治Impending pathological fractures疗前景和治疗过程中面临的挑战。

目的:至少有80%以上的外界信息经视觉获得,视觉是人和动物最重要的感觉。通过视觉,人和动物可以感知外界物体的大小、明暗、颜色、动静,获得对机体生存具有重要意义的各种信息,因此,视觉功能的正常与否至关重要。世界卫生组织调查显示,全球有近22亿人存在视力障碍问题,该问题已经成为一个全球瞩目的重大公共卫生问题。发掘调控视觉信号转导的蛋白,解析这些蛋白分子调控视觉的机制,为人们认知视觉信号传导的过程奠定坚实的理论基础,也为视觉疾病相关药物的开发提供理论依据。视觉疾病常见的为致盲性眼病,其中色素性视网膜炎是最常见的致盲性眼病,主要的病理变化是感光细胞功能进行性退化。前人的研究主要集中在核DNA编码的蛋白,比如PPR、OPA1、FXN和SPG7等蛋白,其突变会导致视觉疾病。随着研究的不断深入,学者们逐渐发现线粒体DNA也在视觉信号转导中具有重要作用,但是线粒体功能异常如何导致视觉疾病的机制人们还知之甚少。线粒体DNA因缺少组蛋白的保护,其突变率比核DNA高10-20倍。线粒体DNA突变在机体中具有阈值效应,是一个连续动态变化的过程,许多视觉疾病的患者在线粒体功能丧失较少的情况下,视觉功能是正常的;但随着线粒体功能逐步丧失,达到一定的阈值就会对视觉产生影响,因此,如何构建一个动态的模型来研究线粒体对视觉的影响至关重要。mt:CoI~(T300I)果蝇,该株果蝇在线粒体的细胞色素c氧化酶亚基I(CoI)中的第300位氨基酸存在点突变。在18°C饲养时,mt:CoI~(T300I)突变体果蝇可正常发育,但在限制性温度29°C时,由于该位点的突变会导致该株果蝇的线粒体功能逐步丧失,进而使mt:CoI~(T300I)突变果蝇在5天内死亡。除此之外,该突变还会导致mt:CoI~(T30immunoturbidimetry assay0I)突变体果蝇的幼虫在29°C饲养无法羽化。因此,我们利用该株突变果蝇模拟视觉疾病中线粒体功能逐渐丧失的人群,研究逐步丧失线粒体功能对视觉的影响,并详细地探究调控的机制。我们的研究可进一步丰富线粒体功能异常诱导视力障碍的研究资料,为临床上存在视力障碍性疾病VX-445研究购买的诊断和治疗提供新思路和治疗方案。方法:果蝇mtDNA与人类mtDNA具有70-80%高度同源性,且光信号传导通路也存在相似性。本研究以果蝇作为模式动物,综合利用遗传学、分子生物学以及电生理等技术研究mtDNA突变与光传导异常引起的视力障碍性疾病之间的相关性。线粒体复合物I参与到氧化磷酸化的过程中,也是线粒体中最大的ETC酶。通过测定线粒体呼吸链复合体I活性观察mt:COI~(T300I)突变株果蝇在29℃条件饲养下线粒体功能是否存在异常。视紫红质蛋白Rh1是视网膜感光细胞中表达最丰富的,通过Western Blot检测Rh1含量的变化,观察感光细胞接受光刺激能力。其次,电生理(ERG)可用来反映视觉信号传导通路中哪一过程存在异常。我们利用ERG检测光传导信号通路中去极化振幅、去活化速率和关灯时瞬时电位振幅的变化,观察mt:CoI~(T300I)突变体的光信号传导通路是否存在缺陷,并通过给予不同强度的光刺激观察mt:CoI~(T300I)突变体果蝇感光细胞处理和加工信息的能力。电镜可观察到视网膜的超微结构,我们可通过电镜检测mtDNA突变引起的线粒体功能异常对感光细胞的数量和视网膜结构的影响。结果:1、18℃饲养时,mt:CoI~(T300I)突变体果蝇的视觉信号传导通路过程正常。2、29℃饲养时,mt:CoI~(T300I)突变体果蝇线粒体复合体I活性降低,线粒体功能的异常。3、线粒体功能异常导致mt:CoI~(T300I)突变体果蝇光受体Rh1蛋白含量减少。并且我们发现,随着年龄的增加,其Rh1蛋白的含量逐PD-0332991化学结构渐降低。4、线粒体功能异常对mt:CoI~(T300I)突变体果蝇的去极化振幅没有影响,但是会延长其去活化速率、降低关灯时瞬时电位振幅和光敏感度。5、线粒体功能异常导致视网膜退化。结论:本研究中表明,线粒体功能异常会导致光敏感度和关灯时瞬时电位振幅降低,去活化速率变慢;而且随着果蝇年龄的增加,Rh1蛋白含量降低,并最终导致视网膜退化。

本研究对分离自山西省马铃薯、甘薯和薯蓣块茎中的腐烂茎线虫8个群体进行形态特征观察和数值测量，对形态数据进行SPSS差异显著性和PCA分析；采用通用引物对其ITS rDNA进行PCR扩增与序列测定，利用Geneious Prime 2019.2.3和DNAMAN 9.0软件计算相似距离和序列比对，Arlequin 3.5软件中的AMOVA模块分析分子变异Medical organization方差，MrBayeAY-22989配制s3.2.7构建贝叶斯系统发育树，并用PopART4.8.4软件构建TCS单倍型网络图。结果表明，腐烂茎线虫群体YH277、YH279、tg38、XF01、CZ15、TY15、tg49属于A型，寄主有甘薯、马铃薯和薯蓣；为害马铃薯群体PX04属于C型。PX04和其余7个群体在形态上存在明显差异，尾部稍尖；PCA分析PX04与其他7个群体可以明显区分开。选用薯类作物为寄主的腐烂茎线虫77条ITS序列构建TCS单倍型网络图，结果显示共享单倍型2个和独享单倍型26个。其中H1单倍型是共享率最高的，推测其可能为祖先单倍型；26个独享单倍型中马铃薯群体独享数目最多，其群体单倍型和核苷酸多样性最丰富，单倍型多样性指数Hd值为0.841，群体间核苷酸多样性指数Pi值为0.00502。AMOVA分析表明，山西省腐烂茎线虫遗传差异主要来源于种群OXPHOS抑制剂间，腐烂茎线虫A型与C型之间存在较大的遗传分化。