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癌症是死亡率最高的疾病之一,其中肝癌的死亡率在癌症中排名第二,给人类生命健康以及家庭和社会带来了沉重的危害。在临床上,治疗肝癌最有效的方法是手术治疗,术前术后同步放疗和化疗,但是手术切除易复发,放疗和化疗副作用大,因此需要研发高效并具有靶向性的治疗肝癌的药物。盐酸阿霉素(Dox)是一种广谱的化疗药物,广泛应用于治疗多种癌症,例如脑胶质瘤、黑色素瘤等,由于Dox不具有特异性,它对心脏和肾脏的副作用成为了治疗肿瘤的瓶颈,为了减轻化学药物的副作用,载体药物递送成为了研究热点。核酸适配体能特异性的结合靶标,具有高亲和力,易于修饰和低免疫原性等优点,是治疗肿瘤的新兴药物,AS1411是第一个用在临床试验中的核酸适配体药物,它能靶向肿瘤细胞表面过表达的核仁素,内化进入肿瘤细胞,并PEG300小鼠且对多种肿瘤细胞有抑制作用,是作为靶向药物载体很好的选择。核酸适配体作为药物或Bio-based chemicals药物载体通常需要通过改造或修饰,优化其结构提高稳定性和生物学活性,本课题以Dox为治疗肝癌的药物,将优化后的AS1411和Dox偶联,探索靶向药物对Hep G2的靶向性和有效性,并进一步研究Hep G2细胞凋亡机制。首先将AS1411通过镜像化处理、5’末端修饰5 k Da聚乙二醇(PEG),以及将序列中间13和24位的T碱基替换为2’-脱氧肌苷(2’-d I),得到三种AS1411衍生物AS1411-J、AS1411-X1和AS1411-X2,通过圆二色谱(CD)、核磁共振氢谱(NMR)、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞技术、荧光倒置显微镜和细胞毒性检测等对三种衍生物进行表征。研究结果表明AS1411、AS1411-J、AS1411-X1和AS1411-X2都具有稳定的G-四聚体结构,在血清中稳定性分别为8、12、12和24 h,和CCRG 81045抑制剂Hep G2细胞的亲和力分别为265.2±38.87、149.9±29.55、225.1±83.01和267.6±88.43 n M,特异性都较好,AS1411和AS1411-J具有较显著的抗肿瘤活性。然后将AS1411-J和Dox偶联,成功合成了靶向药物AS1411-J-Dox,通过细胞毒性和生理指标的检测评估了AS1411-J-Dox的靶向性和抗肿瘤活性。结果显示AS1411-J-Dox能降低Hep G2细胞的活性,而对正常肝细胞无显著影响,具有良好的抗肿瘤活性和靶向性,此外,AS1411-J-Dox也能抑制Hep G2细胞中SOD、GDH、GOT、GPT、T-GSH和LDH等酶的活性。最后通过流式细胞技术、荧光定量PCR和Western blot技术,研究了AS1411-J-Dox的抗肿瘤机制。结果表明,AS1411-J-Dox能将细胞阻滞于S期(19%)和G2/M(25.9%)期,并且可以通过上调p38和BAX的表达,下调Bcl-2表达来调控细胞凋亡。综上所述,AS1411-J稳定性较好、亲和力高、特异性强,是良好的靶向药物载体。偶联产物AS1411-J-Dox是一种具有潜在应用能力的靶向抗肿瘤药物,本研究为癌症的治疗和AS1411抗肿瘤机制的研究提供了参考。

目的:本研究初步探讨卵泡发育过程中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD~+)合成受限介导多囊卵巢综合征(PCOS)颗粒细胞(GCs)凋亡的作用机制,为临床上改善PCOS卵泡发育障碍提供潜在的治疗靶点。方法:1.分析PCOS患者卵巢GCs m RNA的差异表达谱:从GEO数据库下载人卵巢GCs转录组数据,对差异表达基因进行生物信息学分析。2.来曲唑联合高脂饮食诱导建立PCOS大鼠模型,通过体重监测、阴道涂片监测动情周期、放射免疫法检测血清睾酮(T)和H&E染色观察卵巢形态等鉴定模型。3.ELISA、Western Blot(WB)分别检测PCOS大鼠卵巢中NAD~+、乳酸的含量,以及卵巢总蛋白的乙酰化水平。4.分析细胞凋亡相关因子(BAX、BCL-2和CASPASE-3)、NAD~+合成关键酶(烟酰胺磷酸核糖基转移酶,NAMPT)、NAD~selleck产品+依赖性去乙酰化酶(沉默信息调节蛋白2,SIRT2)和乳酸合成关键酶(乳酸脱氢酶A,LDHA)在PCOS大鼠卵巢中的表达变化:(1)q RT-PCR和WB检测各组大鼠卵巢中BAX、BCL-2、CASPASE-3、NAMPT、SIRT2和LDHA的m RNA和蛋白水平;(2)免疫组织化学法检测BAX、BCL-2、CASPASE-3、NAMPT、SIRT2和LDHA在大鼠卵巢的表达定位;(3)Pearson相关性分析用于评估NAD~+、乳酸与细胞凋亡相关因子的相关性。5.添加FK866抑制KGN细胞中NAMPT的表达:(1)CCK-8检测细胞活力;(2)流式细胞术、q RT-PCR和WB检测细胞凋亡率及凋亡相关因子的表达;(3)q RT-PCR、WB检测NAMPT、SIRT2和LDHA的表达;(4)ELISA检测细胞中NAD~+的含量;(5)ELISA检测细胞培养基中乳酸的含量。6.在293T细胞中过表达LDHA的同时添加FK866抑制NAMPT的表达:(1)免疫共沉淀(Co-IP)技术检测LDHA的乙酰化;(2)ELISA检测细胞培养基中乳酸的含量。7.添加AGK2抑制KGN细胞中SIRT2的表达:(1)q RT-PCR和WB检测SIRT2和LDHA的表达;(2)ELISA检测细胞培养基中乳酸的含量。结果:1.分析PCOS患者和对照组妇女的卵巢GCs转录组数据后发现:二者共有207个基因在GCs中差异表达,其中上调的基因143个,下调的基因64个;GO和KEGG富集分析发现,糖酵解和烟酸-烟酰胺代谢通路被显著富集,热图聚类分析发现PCOS组中LDHA和SIRT2的表达显著下调。2.与对照组大鼠ML intermediate相比,PCOS组大鼠体重(3VEGFR抑制剂74.12±11.99 vs 270.13±8.67,P<0.01)显著增加,动情周期停滞在间期,血清T水平(4.85±1.48 vs0.25±0.20,P<0.01)明显升高,卵巢中囊性卵泡(11.33±2.42 vs 2.50±1.05,P<0.01)显著增多和黄体数量(3.50±1.05 vs 9.67±1.97,P<0.01)显著减少。3.PCOS组大鼠卵巢组织中NAD~+(0.44±0.04 vs 0.75±0.01,P<0.01)和乳酸(0.39±0.01 vs 0.50±0.03,P<0.05)的含量均显著降低,而总蛋白乙酰化显著增强。4.PCOS组大鼠卵巢GCs中BAX和CASPASE-3的表达显著上调(P<0.05),BCL-2、NAMPT、SIRT2和LDHA的表达均显著下调(P<0.05);通过Pearson相关性分析得出,PCOS大鼠卵巢组织中NAD~+水平与Bax(r=-0.98,P<0.01)、Caspase-3(r=-0.99,P<0.01)的表达呈显著负相关,与Bcl-2(r=0.99,P<0.01)的表达呈显著正相关,且NAD~+与乳酸水平(r=0.93,P<0.01)呈显著正相关。5.NAMPT沉默后,KGN细胞活力降低、凋亡率增高(P<0.05),BAX和CASPASE-3的表达显著上调(P<0.05),BCL-2、NAMPT、SIRT2和LDHA的表达显著下调(P<0.05)。6.在过表达LDHA的基础上沉默NAMPT,LDHA的乙酰化增强和乳酸(6.94±0.20 vs 8.55±0.55,P<0.05)的含量显著降低。7.SIRT2沉默后,KGN细胞中SIRT2、LDHA的表达显著下调(P<0.05),乳酸的含量显著降低(7.08±0.04 vs 7.46±0.18,P<0.05)。结论:PCOS大鼠卵巢中NAD~+和乳酸含量显著降低,GCs的凋亡显著增加。NAD~+合成受限可促进GCs的凋亡,提高LDHA的乙酰化水平并抑制其表达,阻滞糖酵解进程和降低乳酸水平,从而抑制卵泡发育所需的能量供应。

植物病原菌的检测与鉴定在保护我国农林业经济与生态安全方面有着重要意义,是检疫工作的重中之重。等温扩增技术具有高效、特异性,可快速实现即时检测,已被应用于检疫工作中。Bst DNA聚合酶是等温扩增中的核心酶,具有较强的热稳定性、链置换活性和聚合酶活性,在恒温条件下快速、高效、特异性地扩增模板。本研究前期基于环介导等温扩增技术(loop-mediated let-7 biogenesisisothermal amplification,LAMP)建立了核酸检测体系,但DNA提取过程中加入的表面活性剂一定程度上影响了体系中Bst酶的活性,导致实验结果不稳定、重复www.selleck.cn/products/AZD2281(Olaparib)性低。本研究拟基于已解析的Bst聚合酶蛋白结构,设计相关关键氨基酸位点的突变,并表达纯化这些Puromycin小鼠突变体,比较突变体与野生型的酶活力,最终设计出可耐受1%表面活性剂的高效突变体,从而建立Bst酶在植物病原物检测的稳定体系,为田间病害监测及进出口检疫工作提供预警信息。

急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是一种常见的呼吸系统急危重症,死亡率高,目前缺乏有效的治疗手段。内皮糖萼是位于血管内皮细胞表面的多糖复合结构,它不仅是血管壁的选择性通透性屏障,还能限制血细胞与内皮细胞的接触,维持血管内皮的正常微环境。内皮糖萼的破坏会增加血管的通透性,加速肺水肿,促进急性肺损伤的发生与发展。在研究中,我们创新性地提出了以硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)为修复材料,将其种植在内皮糖萼缺损部位的内皮细胞膜上,以修复内皮糖萼的策略。首先,制备E-选择素结合肽(E-selectin-binding peptides,EBP)修饰并加载四嗪(Tetrazines,Tz)的膜融合脂质体(Fusion liposomes,FLs),利用EBP对炎症刺激的内皮细胞表面高表达的E-选择素的靶向性,将Tz锚定到内皮细胞膜上,然后注入反式环辛烯(Trans cyclooctene,TCO)修饰的HS。随后,Tz和TCO之间的生物正交反应可以将HS固定在内皮细胞膜上,从而修复内皮糖萼。并以急性肺损伤为疾病模型,阐明该给药系统如何修复内皮糖萼,为靶向修复内皮糖萼的新型药物制剂的研究和临床应用提供理论和实验依据。本研究主要包括以下6部分内容:1.材料合成及结构鉴定通过E-选择素结合肽(E-selectin binding peptide,EBP)上的巯基与马来酰亚胺-聚乙二醇-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(Maleimide-polyethylene glycol-dimethyl myristoyl phosphatidylethanolamine,DMPE-PEG-MAL)上的马来酰亚胺基团(Maleimide,MAL)发生加成反应,合成了能与E-选择素特异性结合的靶向脂质材料EBP-PEG-DMPE。其次,Tz与二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(Dimyristoylphosphatidylethanolamine,DMPE)通过酰化反应共价连接,合成锚定材料Tz-DMPE。最后,通过N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(N-hydroxysuccinimide,NHS)参与的酰化反应,在HS上修饰TCO,合成了糖萼修复材料TCO-HS。2.EBP-Tz-FLs处方工艺优化和理化性质表征采用薄膜分散法制备膜融合脂质体EBP-Tz-FLs。研究了(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵((2,3-dioloyl-propyl)-trimethylammonium chloride,DOTAP)含量、EBP-PEG-DMPE/Tz-DMPE质量比、超声时间、超声功率和水化体积对EBP-Tz-FLs粒径、电位及细胞摄取的影响。最终确定20%DOTAP、EBP-PEG-DMPE/Tz-DMPE质量比为5:4时是EBP-selleck MC3Tz-FLs的最佳处方,超声功率390 W、超声时间7 min、水化体积10 m L是制备EBP-Tz-FLs的最佳处方工艺。制备得到的EBP-Tz-FLs粒径为122.80±5.00 nm且分布均匀,电位为42.25±3.67 m V。透射电镜的结果显示EBP-Tz-FLs呈圆形的脂质体样结构,稳定性实验表明EBP-Tz-FLs在4℃下具有较好的稳定性。3.EBP-Tz-FLs和TCO-Cy5体外细胞学研究首先考察了温度以及能量抑制剂叠氮化钠(NaN_3)对EBP-Tz-FLs细胞摄取的影响,并利用荧光显微镜观察了与HUVECs孵育不同时间下EBP-Tz-FLs在细胞内的分布情况,实验表明EBP-Tz-FLs有较好的膜融合能力。利用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)构建细胞炎症模型,并提前给予E-选择素结合肽竞争性结合E-选择素位点。结果说明:E-选择素结合肽的修饰使得EBP-Tz-FLs具有E-选择素靶向性。EBP的修饰能够将载有Tz的脂质体靶向递送至肺内皮细胞糖萼破损的部位,再给予TCO-Cy5,利用激光共聚焦和细胞流式分析仪测定TCO-Cy5的荧光强度,发现在给予EBP-Tz-FLsE7080供应商后有更多的TCO-Cy5能够修饰到HUVECs上。进一步,利用多功能酶标仪检测了细胞膜上TCO-Cy5的荧光强度,实验结果证明EBP-Tz-FLs+TCO-Cy5组在细胞膜上的分布最多。4.EBP-Tz-FLs和TCO-Cy5体内组织分布首先利用LPS滴鼻法成功构建了急性肺损伤小鼠模型。将DID标记的EBP-Tz-FLs(EBP-Tz-FLs@DID)静脉注射入急性肺损伤小鼠体内,在各个时间点下其在肺部的荧光强度强于没有EBP肽修饰的膜融合脂质体。结果表明EBP肽的修饰能够使膜融合脂质体靶向至急性肺损伤小鼠的肺组织。随后,先将EBP-Tz-FLs尾静脉注射入血,1 h后将TCO-Cy5注射入小鼠体内。结果显示EBP-Tz-FLs+TCO-Cy5在实验的整个过程中,都较其他组更多地分布在肺组织中,且持续时间更长。5.评估EBP-Tz-FLs+TCO-HS对糖萼的修复以及急性肺损伤的治疗效果利用LPS构建炎症刺激后的内皮细胞模型,给药后用FITC标记的麦胚凝集素(FITC labelled wheat germ agglutinin,FITC-WGA)来标记内皮糖萼,EBP-Tz-FLs+TCO-HS组有最强的FITC-WGA荧光强度,说明EBP-Tz-FLs+TCO-HS可以较好地修复内皮糖萼。之后,运用FITC标记的白蛋白(FITC labelled bovine serum albumin,FITC-BSA)来检测该系统对HUVECs细胞通透性的影响,EBP-Tz-FLs+TCO-HS能够较好地改善内皮细胞的通透性。最后,利用羧荧光素二乙酸酯-琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluorescein diacetate-succinimidyl ester,CFDA-SE)标记白细胞,考察白细胞对内皮细胞的粘附作用,试验发现EBP-Tz-FLs+TCO-HS能够减少白细胞的粘附。在小鼠体内时,肺组织冰冻切片利用AF680标记的血小板-内皮细胞粘附分子抗体(AF680 labelled platelet endothelial cell adhesion molecule-1 antibody,AF680-CD31抗体)标记内皮血管,FITC-WGA标记糖萼,荧光成像看出,EBP-Tz-FLs+TCO-HS能够修复肺内皮糖萼。进一步,考察证明EBP-Tz-FLs+TCO-HS能够改善肺血管的渗透性。在急性肺损伤治疗作用的研究中,无论是离体肺组织水肿情况、肺湿干重比、肺组织匀浆液中TNF-α水平、肺组织H&E染色结果、急性肺损伤小鼠存活率,还是肺泡灌洗液中总蛋白浓度及细胞学分析,都表明EBP-Tz-FLs+TCO-HS具有良好的治疗急性肺损伤的能力。6.EBP-Tz-FLs和TCO-HS的体内外安全性EBP-Tz-FLs制剂无溶剂残留,EBP-Tz-FLs和TCO-HS的体外溶血百分率符合临床要求。三种材料:EBP-PEG-DMPE、Tz-DMPE以及TCO-HS,在0-160μg/m L的浓度时细胞存活率均大于70%。正常小鼠连续静脉注射EBP-Tz-FLs+TCO-HS四天,在整个给药周期中,小鼠体重无显著变化,各个脏器未见明显的病理学变化,血常规及生化指标都与生理盐水(Saline)组相似。以上结果表明EBP-Tz-FLs+TCO-HS的体内外安全性较高。研究结果显示,EBP修饰的膜融合脂质体可以实现良好的肺部靶向性,装载Tz的膜融合脂质体能够与TCO发生生物正交反应,进一步将HS靶向递送至糖萼受损的部位,起到更好地治疗效果。并且,EBP-Tsymbiotic bacteriaz-FLs+TCO-HS具有较好的安全性。这些结果表明,这种两步靶向递送系统可以有效增加HS修饰到糖萼受损部位的含量,可作为有效调节纳米载体体外和体内行为的有前景的工具。

花青素苷是草莓果实重要的营养物质,对果实色泽的形成至关重要。在我国,草莓主要在冬春季进行设施栽培,设施内光照不足导致草莓果实着色不良,商品性较低。因此,深入解析草莓果实发育与成熟过程中花青素苷代谢的调控机制对草莓果实品质形成至关重要。本研究新发现了两个WRKY转录因子—Fa WRKY44和Fa WRKY46,其均能影响草莓果实中花青素苷的积累,但其中的调控机制还不明确。因此,本研究采用生物信息学、qRT-PCR、过表达或沉默、转录组学和代谢组学、DAP-seq、酵母单/双杂交等技术手段探讨了Fa WRKY44和Fa WRKY46的表达特性及其调控草莓花青素苷代谢的机制。主要的研究内容和结果如下:1.采用PCR方法从两种二倍体野生草莓‘Ruegen’和‘五叶草莓’,两种八倍体栽培草莓‘红颜’和‘丰香’中分别扩增了Fa WRKY44和Fa WRKY46及其同源基因的CDS序列,结果显示WRKY44和WRKY46的CDS或氨基酸序列在这4种草莓中均相对保守。将Fa WRKY44或Fa WRKY46在烟草叶片中进行亚细胞定位,结果显示其蛋白均定位在细胞核中。将Fa WRKY44或Fa WRKY46连接在p ET-32a(+)或p GEX-4T-1原核表达载体上,使用大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株均能够诱导出可溶diABZI STING agonist浓度的目的蛋白。采用PCR方法从‘红颜’中扩增了Fa WRKY44和Fa WRKY46的启动子,序列分析显示Fa WRKY44的启动子序列(2131 bp)与森林草莓比较接近;Fa WRKY46存在两种启动子序列,其中promoter 1(2419 bp)与森林草莓中的更接近,promoter 2缺失了一段约700 bp的序列。2.采用qRT-PCR方法分析了Fa WRKY46和Fa WRKY44的组织特异性和在不同处理条件(低钾、干旱、低磷、ABA、高盐、低温和红蓝光)下的表达特性。结果表明,Fa WRKY46在‘红颜’草莓的根、茎、匍匐茎、幼叶、功能叶、花和不同发育时期的果实中呈现出强烈的组成型表达趋势,且表达水平极高;Fa WRKY44表现出比较弱的组成型表达趋势,在功能叶和花中相对较高,而在全红的果实中表达水平略低一些。Fa WRKY46对低磷、低温和高盐胁迫相对更敏感,Fa WRKY44则对低钾和低温更敏感。Fa WRKY46和Fa WRKY44均无法快速响应红光或蓝光处理。3.采用VIGS或瞬时过表达方法来改变Fa WRKY46或Fa WRKY44的表达水平。结果显示,在‘红颜’草莓果实中沉默Fa WRKY46或Fa WRKY44均能够抑制果肉中花青素苷的积累,在‘小白’草莓中过表达Fa WRKY46恢复了果肉中花青素苷的积累,但过表达Fa WRKY44则不能。采用qRT-PCR和RNA-seq方法进行了进一步分析,结果发现Fa WRKY46或Fa WRKY44对草莓果实花青素苷代谢的调控更有可能是通过影响花青素苷的转运、储存或降解(稳定性)等后期过程来实现的,而对花青素前期的合成及相关结构基因的影响有限。将Fa WRKY44在拟南芥中过表达后发现,其能够增加拟南芥野生型或3个ttg2突变体(CS2106724、SALK＿204777C、SALK＿206852C)的种子中原花青素的积累。4.采用qRT-PCR、HPLC、转录组学、靶向/类靶向代谢组学、DAP-seq等方法分析了调控‘红颜’和‘小白’草莓果肉的关键基因。结果表明,Fa MYB10或Fa TT19不是引起‘小白’草莓果肉中色素缺失的关键因素。苯丙烷生物合成途径中的Fa C4H对控制草莓果肉着色至关重要,其转录水平受抑制导致了‘小白’草莓果肉中无法积累花青素苷,且这种抑制不是由启动子序列甲基化引起的。Fa WRKY46通过调节Fa C4H的转录以及下游靶基因UFGT7、H~+-ATPase等来影响花青素苷的积累。5.采用酵母单杂交、酵母双杂交、Bi FC和生物信息学预测等方法筛选Fa WRKY44或Fa WRKY46的互作蛋白和上游调控基因。结果表明,Fa WRKY44Ascorbic acid biosynthesis与MBW复合体成员Fa TTG1、Fa EGL3或Fa LWD1-like之间存在蛋白互作,与Fa MYB1或Fa MYB10之间无互作。Fa WRKY46与Fa LWD1、Fa LWD1-like、Fa EGL3、Fa MYB9、Fa MYB10或Fa MYB11之间存在互作,与Fa MYB1、Fa MYB5之间无互作。此外,Fa WRKY44与PR1A、U-box 19、GL2、TT1、MYB59或ABC转运蛋白可能存在互作关系;Fa WRKY46与Nuclear transport factor 2、Dp-1转录因子、PP2C37、MAP3K1、PP2C23、PP2C4、ERF4、b HLH92、MYB39或ABI4等可能存在蛋白互作。Fa WRKY46的启动子能够被MYC2、b HLH13、NAC18、Zinc finger protein 1、WRKY3和FK506-binding protein 4-like结合。6.采用qRT-PCR和瞬时过表达等方法分析了MYBs、MAPKs和ABA信号通路基因对Fa WRKY44或Fa WRKY46转录水平的获悉更多影响。结果显示,草莓果肉中Fa WRKY44或Fa WRKY46的表达水平相对于果皮更容易受到Fa MYB5或Fa MYB10的调控。磷酸激酶Fa MAPK3、Fa MAPK4-2或Fa MAPK16能够影响草莓果肉中Fa WRKY44或Fa WRKY46的表达水平。ABA信号通路中的Fa NCED1、Fa Sn RK2.2或Fa Sn RK2.6对草莓果肉中Fa WRKY46的表达有促进作用,但对果肉中Fa WRKY44的转录则无明显影响。采用酵母双杂交和改进的双荧光素酶方法分析了Fa BT2蛋白对Fa WRKY44或Fa WRKY46蛋白水平的影响。结果表明,Fa BT2与Fa WRKY46或Fa WRKY44蛋白之间均无互作,但Fa BT2蛋白能够强烈的诱导Fa WRKY46蛋白的降解。

光动力治疗(PDT)是一种非侵入性的治疗方法,在癌症治疗领域备受关注。然而,外部激发光有限的组织穿透深度严重阻碍了PDT的进一步应用。近年来,研究者提出了自发光光动力治疗,用于克服光源渗透深度浅的难题。该方法是由化学发光底物、生物发光酶和长余辉发光材料,通过共振能量转移过程激发光敏剂,从而实现不需要外部光源的光动力治疗。然而,由于这些自发光光动力疗法缺乏对肿瘤部位的光照刺激,导致对肿瘤部位的选择性较差,使治疗效果受到限制。为此,研究者发展了一些内源性刺激响应型自发光PDT体系,能够有效提高肿瘤部位的治疗效果。然而,由于能量转移过程的响应方式有限,导致自发光PDT的内源性刺激仍局限于炎症部位和肿瘤微环境中过表达的氧化还原底物,如活性氧(ROS)、髓过氧化物酶(MPO)和谷胱甘肽(GSH)等,目前仍然缺乏能够用于早期肿瘤治疗的自发光PDT系统。Micro RNAs(miRNAs)是一类短的非编码单链RNA(通常为20-23个碱基),其异常表达与肿瘤的发生和发展密切相关。随着对miRNAs在疾病中的作用的深入研究,miRNAs响应型治疗在早期治疗中显示出巨大的潜力。基于此,在本论文中,我们构建了一种基于内源性miRNAs响应型化学发光共振能量转移(CRET)纳米system immunology系统以实现高效自发光光动力治疗。主要工作内容如下:1、内源性miRNAs响应型CRET纳米材料的制备与表征。通过水热法合成Ui O-66-NH_2,负载二氢卟吩e6(Ce6)和核酸发卡(H1),得到结构稳定的纳米材料Ui O-66-Ce6/H1。然后,对该纳米材料进行全面的表征。其性能研究表明,miRNA-21能够有效地激活Ui O-66-Ce6上的H1,并和游离的H2发生催化发卡自组装(CHA)反应,形成Ui O-VP-16生产商66-Ce6/H1-H2纳米复合物,同时,在MOFs上组装的DNAzymes能有效催化化学发光反应,通过CRET过程刺激邻近的光敏剂Ce6,从而生成大量活性氧(ROS)。2、内源性miRNAs响应型CRET纳米系统在肿瘤治疗中的应用。以人乳腺癌细胞(MCF-7)为细胞模型进行实验,证明了该纳米系统能够被细胞有效摄取,在化学发光底物的存在下,能够对细胞内miRNA-21实现特异性响应,Dibutyryl-cAMP细胞培养同时产生具有细胞毒性的ROS,从而导致癌细胞的凋亡。以MCF-7荷瘤小鼠为动物模型进行实验,证明了内源性miRNA响应型CRET纳米系统具有良好的体内抗肿瘤效果。总之,我们通过构建内源性miRNAs响应型CRET纳米系统,成功实现了肿瘤部位的响应性治疗,在癌症的精确治疗方面具有良好的应用前景。

氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)是由碳原子以sp~2杂化形式单层形成二维网状结构的石墨烯的衍生物。它的二维空间平面含有-OH、-COOH、-O-、-C=O等多种含氧官能团,-COOH与-C=O可与胺基反应,可降低氧化石墨烯毒性,提高生物相容性。冬凌草甲素(Oridonin,ORI)为唇形科香茶菜属植物冬凌草的主要活性成分,结构属于贝壳杉烷型四环二萜类,对肿瘤细胞作用显著,但冬凌草甲素难溶于水,生物利用度低。本研NSC 127716生产商究以聚乙烯亚胺和叶酸为原料,通过酰胺反应修饰氧化石墨烯,并对其进行表征,再负载冬凌草甲素考察此制剂水溶性,稳定性,抗肿瘤活性及生物利用度。主要研究方法及结果如下:1.功能化氧化石墨烯复合材料(GO-PEI-FA)的制备以氧化石墨烯(GO)、聚乙烯亚胺(PEI)和叶酸(FA)为原料,利用酰胺反应制备功能化氧化石墨烯复合材料(GO-PEI-FA),并通过紫外光谱、红外光谱等手段,证明合成GO-PEI-FA复合材料。2.GO-PEI-FA-ORI制剂的制备及载药工艺的优化以包封率为评价标准,负载ORI,制备GO-PEI-FA-ORI制剂,通过单因素试验考察影响包封率的因素,最终选取叶酸的加入量,冬凌草甲素的浓度和GO-PEI-FA复合载体的浓度三个因素设计Box-Behnken实验,得GO-PEI-FA复合载体负载冬凌草甲素的最佳工艺为:叶酸的加入量为75.4 mg,冬凌草甲素的浓度为0.196 mg·m L~(-1),GO-PEI-FA复合载体的浓度为0.249 mg·m L~(-1)。以此最优条件下载药,包封率为93.83%,载药量为42.48%。3.GO-PEI-FA-ORI制剂理化性质考察及体外释放研究GO-PEI-FA-ORI制剂平均粒径为112.8 nm,PDI为0.174,zeta电位为28.9 m V,可在水、PBS、培养基和胎牛血清中更加稳定的分散。采用动态透析法,对GO-PEI-FA-ORI制剂进行体外释放实验,冬凌草甲素与GO-PEI-FA-ORI制剂体外释放呈p H依赖性,GO-PEI-FA-ORI制剂可缓慢持续地释放冬凌草LEE011细胞培养甲素。绘制累计释放曲线,进行动力学模型拟合,冬凌草甲素的体外释放行为符合一级动力学模型,GO-PEI-FA-ORI制剂的释放行为符合Ritger-Peppas方程模型。4.体外细胞实验采用CCK-8法考察冬凌草甲素、GO-PEI-FA-ORI制剂和GO-PEI-FA复合载体对人乳腺癌细胞(MCF-7)的生长抑制作用,GO-PEI-FA复合载体表现出低毒性,各实验组培养MCF-7细胞24 h,ORI原料药对MCF-7细胞的生长抑制作用强于GO-PEI-FA-ORI制剂,继续培养至48 h,72 h,GO-PEI-FA-ORI制剂对MCF-7细胞的生长抑制作用强于ORI原料药(P均<0.001)。通过激光共聚焦显微镜,考察MCF-7细胞对不同实验组的摄取能力,荧光图像显示,MCF-7细胞摄取GO-PEI-FA-ORI制剂的能力强于ORI原料药,且呈浓度依赖性。5.大鼠体内药代动力学实验对SD大鼠尾静脉注射冬凌草甲素溶液和GO-PEI-FA-ORI制剂,于5,15,30 min,1,2,4,6,8,12,24,48 h眼内眦静脉丛取血,测定血药浓度,计算得冬凌草甲素和GO-PEI-FA-ORI制剂在大鼠体内的半衰期分别为4.99 h和29.16 h,AUC_((0-t))分别为4.92μg·h·m L~(-1)和20.75μg·h·m L~(-1)。GO-PEI-FA-ORI制剂半衰期明显延长,相对于注射冬凌草甲素原料药来说,生物利用度提高。本研究通过酰胺反应制备得到了功能化氧化石墨烯复合材料,用于负载ORI药物,得到负载率高、稳定性好、副作用小、作用时间长的GO-PEI-FA-ORI制剂,为氧connected medical technology化石墨烯的功能化研究提供理论依据。

目的 分析心理疏导配合认知教育对老年高血压伴抑郁症患者血压、情绪控制效果的影响。方法 选取2021年3月至2022年8月期间该院收治的80例老年高血压伴抑郁症患者为研究对象，并依据GSKJ4患者的护理方式差异将其分入观察组（40例）和对照组（40例），对照组老年患者采用常规护理，观察组老年患者在常规护理上实施心理疏导配合认知教育。比较两组高血压伴抑郁症患者护理前后血压水平、护理后情绪状况（指标包括：焦虑、抑郁）、生活质量评分（指标包括：睡眠评分、精神评分、体力评分、食欲评分）改善情况。结果 两组高血压伴抑郁症患者护理前睡眠评分、精神评分、体力评分、食欲评分等生活质量评分和焦虑、抑郁等情绪状况评分以及血压水平biomimetic transformation相比无明显差异（P>0.05），护理后两组高血压伴抑郁症患者以上评分均显著改善（P<0.05），且观察组高血压伴抑郁症患者睡眠评分、精神评分、体力评分、食欲评分等生活质量评分和焦虑、抑郁等情绪状况评分以及血压水平改善情况均显著优于对照组（P<0.05）。结论 心理疏导配合认知教育能GDC-0068有效提升老年高血压伴抑郁症患者的血压控制水平，改善患者的不良情绪状况，提升患者的生活质量。

研究背景:补骨脂是临床常用的补益类中药,具有补肾壮阳,温脾止泻等功效,多用于治疗肾虚阳痿、腰酸冷痛、骨质疏松等多种疾病,然而,近年来补骨脂及其相关制剂导致肝损伤不良反应的事件频繁发生。课题组前期通过大量的临床病例和基础研究,证明了补骨脂可导致特异质肝损伤,且具有免疫特异质属性。但是,迄今补骨脂致特异质损伤的易感物质及作用机制尚不清楚,难以形成有针对性的补骨脂安全用药风险防控策略。为此,本文拟对补骨脂特异质肝损伤的物质基础和作用机制开展探索性研究,以期为科学制定补骨脂及其相关制剂肝损伤风险防控策略提供参考依据。研究目的:本研究旨在探索补骨脂特异质肝损伤的主要易感物质及selleck作用机制,并根据相应的成因机制制定补骨脂安全用药风险防控策略。研究方法:1.基于小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs),构建LPS诱导的体外炎症小体激活模型,筛选补骨脂特异质肝损伤易感成分。采用Western Blot(WB)技术检测补骨脂中活性成分对炎症小体激活相关蛋白caspase-1 p20表达的影响、以酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测炎症小体激活下游炎症因子IL-1β、TNF-α的含量。2.建立LPS诱导的小鼠免疫应激模型,对比易感成分在正常状态及免疫应激状态下导致肝损伤的情况。以赖氏法、ELISA、QRT-PCR法测定血清中AST、ALT、IL-1β、TNF-α和肝脏IL-1β、IL-18、TNF-α含量,采用WB技术检测小鼠肝脏组织中caspase-1 p20蛋白表达,进一步地,利用H&E染色法观察各组小鼠肝脏病理学变化。3.在LPS诱导的炎症小体活化模型基础上,分别用药理学(NLRP3拮抗剂MCC950、NLRC4拮抗剂echinatin、AIM2拮抗剂ODN)和遗传学(Nlrp3基因敲除、靶向干扰Aim2基因)阻断/敲除/干扰NLRP3、NLRC4、AIM2炎症小体激活,并观察对易感成分诱导炎症小体活化的影响。采用WB法分别检测细胞上清caspase-1 p20蛋白表达变化,以ELISA检测法测定细胞上清IL-1β、TNF-α含量变化。4.在易感成分激活炎症小体的基础上,检测易感成分对炎症小体激活相关上游靶标的影响,明确其激活炎症小体的机制。采用WB技术分析易感成分对炎症小体激活相关的ASC寡聚化的影响;以流式细胞术测定易感成分对线粒体膜电位及ROS产生的影响;利用免疫荧光检测法观察易感成分对线粒体形态及细胞内炎症小体组装相关蛋白结合的影响。5.以系统辨靶论治为指导思想,提出基于效应靶标互作的补骨脂肝毒性防控策略。将甘草中抑制炎症小体活化的成分甘草多糖、刺甘草查尔酮分别与补骨脂中激活炎症小体的成分进行组分配伍,采用WB法检测组分配伍前后caspase-1p20蛋白及ASC寡聚变化、以ELISA法测定配伍前后IL-1β、TNF-α的含量变化。研究结果:1.本课题在前期建立的体外肝损伤药物筛选评价体系基础上,研究了补骨脂中多种活性成分对炎症小体的调节作用。结果表明补骨脂中单萜酚类成分补骨脂酚(Bakuchiol,Bak)、香豆素类成分补骨脂定(psoralidin)均可诱导caspase-1p20蛋白表达、显著增加细胞上清IL-1β和TNF-α的含量,表明两者均可激活炎症小体,且补骨脂酚激活效应更强,提示Bak可能是补骨脂特异质肝损伤的主要易感成分。2.基于LPS诱导的免疫应激小鼠模型,研究Bak致特异质肝损伤的作用。结果表明,Bak(15、30 mg/kg)在正常小鼠中不会诱导血清中ALT、AST、IL-1β、TNF-α含量增加,也不会增加肝脏中IL-1β、IL-18和TNF-α表达水平,且肝脏组织无炎性浸润、肝细胞完整,表明该给药剂量不会造成肝脏损伤;Bak(15、30mg/kg)在LPS诱导的免疫应激模型中可显著增加小鼠血清中ALT、AST、IL-1β、TNF-α和肝脏中IL-1β、IL-18、TNF-α表达,剂量依赖地增加肝脏caspase-1 p20蛋白表达,还可加重肝脏组织炎性浸润、肝细胞损伤等病理变化,表明Bak主要通过激活炎症小体从而导致免疫特异质肝损伤。3.基于LPS诱导的体外炎症小体激活模型,使用多种抑制剂(MCC950、echinatin、ODN)、Nlrp3基因敲除及靶向沉默Aim2基因表达,研究Bak诱导炎症小体激活的特异性。结果表明,MCC950、echinatin、敲除Nlrp3基因均不影响Bak诱导的caspase-1 p20蛋白表达及IL-1β、TNF-α的释放;AIM2抑制剂及干扰Aim2基因表达均可以显著抑制Bak诱导的炎症小体激活,表明Bak主要通过激活AIM2炎症小体诱导机体过度炎症反应从而导致特异质肝损伤。4.在Bak激活炎症小体的基础上,对AIM2炎症小体组装激活相关的调控靶标进行了研究。结果表明,Bak可诱导AIM2炎症小体激活相关的ASC寡聚化;通过对细胞线粒体的形态、膜电位、ROS进行观察和测定,发现Bak可损伤线粒体形态、降低线粒体膜电位、增加线粒体ROS的产生,推测Bak可能是通过诱导线粒体损伤使得线粒体DNA异常释放至胞质中而被AIM2感受器识别,激活AIM2炎症小体。进一步,通过免疫荧光法观察到Bak可促进胞质中DNA与AIM2聚合,表明NirogacestatBak主要是通过诱导线粒体损伤释放线粒体DNA从而激活AIM2炎症小体。5.分别Biomolecules将甘草多糖、刺甘草查尔酮与Bak、补骨脂定联合使用,发现组分配伍后可显著抑制Bak、补骨脂定诱导的caspase-1蛋白表达、ASC寡聚化以及炎症因子IL-1β、TNF-α的产生。以上结果表明,甘草中的组分如甘草多糖、刺甘草查尔酮可分别抑制Bak、补骨脂定诱导的炎症小体激活,起到基于效应靶标调控的配伍减毒作用。研究结论:本课题对补骨脂特异质肝损伤的易感成分及潜在机制进行了研究。采用体外免疫活化模型,筛选并发现了补骨脂中激活炎症小体的主要化学成分为Bak,并联合体内免疫应激模型明确了Bak是补骨脂特异质肝损伤的主要易感成分;系统地阐释了Bak激活AIM2炎症小体的作用特点及靶标机制;初步明确补骨脂-甘草组配伍可抑制补骨脂中多成分诱导的过度炎症反应。该课题揭示了补骨脂诱导特异质肝损伤的易感物质及可能的分子机制,提出了基于效应靶标互作的补骨脂肝毒性风险防控策略,为补骨脂临床安全用药提供了参考依据。

点柄粘盖牛肝菌(Suillus granulatus)是一种珍贵的野生食用菌,因其风味独特、营养丰富,而广受消费者喜爱。由于鲜品不易贮存,干制成为其生产中的主要加工方式。干制后的点柄粘盖牛肝菌具有更加浓郁的风味,但随着储藏时间的延长,其风味和营养品质大大降低。目前关于提升食用菌干制品风味的研究鲜有报道,因此探索可提高干制食用菌风味品质的处理技术具有重要意义。光照和氧气是影响食品风味和营养品质且易于调节的主要外界条件。光是一种复合光,具有能量,包括不同能量的单色光selleckchem Gefitinib-based PROTAC 3,可通过诱导某些光化学反应而影响食用菌品质。由于干制品大量失水,氧气对其影响或许远小于光照。包装是实现对光氧环境控制的一种最安全、方便、经济的方式。本研究以在60℃下干制的点GW4869细胞培养柄粘盖牛肝菌为研究对象,首先通过透光真空包装、避光真空包装、透光非真空包装、避光非真空包装四种包装方式比较了光和氧对干制点柄粘盖牛肝菌在储藏过程中风味品质的影响,明确光可提高其风味品质。为从光的组成上揭示其影响机制及推进该技术在食用菌加工产业中的应用,进而深入探究了不同能量的单色光对干制点柄粘盖牛肝菌风味、营养、复水性、质地和微观结构的影响,主要研究结果如下:(1)透光包装下鲜味氨基酸含量、等效鲜味浓度、电子舌鲜味评分和香气综合评分在储藏4-6个月时相对较高。苯乙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和香叶基丙酮均在透光包装中含量较高,平均气味活性值分别为27、218和174,是干制点柄粘盖牛肝菌的关键香气成分。氧对干制点柄粘盖牛肝菌的风味无显著影响。因此,光可提高干制点柄粘盖牛肝菌的风味。(2)蓝光处理的干制点柄粘盖牛肝菌的鲜味氨基酸含量、5′-核苷酸含量、EUC值和电子舌鲜味得分、香气品质的综合得分均较高。五种光处理下的鲜味和香气均在光照6天和9天时较好。偏最小二乘判别分析表明不同光处理之间苯甲醛、甜味、芳樟醇、4-苯基吡啶、香叶基丙酮、天冬氨酸、谷氨酸、2,5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪、1-辛烯-3-醇、5-庚烯-2-醇、苯乙醇和甲基庚烯酮的差异是导致风味差异的主要原因。(3)蓝光处理的干制点柄粘盖牛肝菌中可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、黄酮含量、多酚含量和复水比均相对较高且在光照6天Medical care时最高,复水后的硬度和弹性等质构值相对较低。蓝光处理下的孔隙结构更为清晰,孢子损伤程度最大,这从微观结构角度揭示了蓝光处理下干制点柄粘盖牛肝菌的复水性、质地和营养品质相对较好的原因。综上,光可提高干制点柄粘盖牛肝菌的风味品质,蓝光下不仅具有最佳的风味,也具有较好的营养及复水特性。因此,蓝光可作为提高干制食用菌品质的一种简单高效的处理技术。本研究在干制食用菌品质改善上具有一定的理论意义和良好的应用前景。