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研究背景与目的:前列腺癌作为老年男性最常见的恶性肿瘤疾病,严重影响男性生命健康和生活质量。无论是在西方国家还是在我国前列腺癌的疾病负担都在增加。局限性疾病经治疗后具有较高的5年生存率,然而一旦出现转移或进展为去势抵抗性前列腺癌通常有不良的预后。因此,探索前列腺癌中新的生物标志物是必要的。环状RNA(circular RNA,circRNA)是由前体mRNA经过反向剪接环化而成,作为近十年被深入探索的“非编码”RNA已经得到充分的认识。许多研究已经证明circRNA在癌症中异常表达,参与肿瘤恶性进展的调控。在前列腺癌中许多异常表达的circRNA也被报道,circRNA具有非常大的潜力成为前列腺癌诊断、治疗及预后生物标志物。利用生物信息学分析我们发现circMAML3(hsa＿circ＿0125392)目前未见相关研究报道,在本研究中我们对circMAML3在前列腺癌中作用及其分子机制进行了探索。研究方法:(1)基于文献报道的25对前列腺癌组织与正常组织测序结果,从中筛选出差异表达的circMAML3(hsa＿circ＿0125392),进一步使用circAtlas 2.0数据库验证。(2)circMAML3的环状特性与稳定性采用sanger测序、琼脂糖凝胶电泳实验(分析circMAML3在cDNA与gDNA中扩增情况)、RNase R实验及放线菌素D实验分析;circMAML3在PC3和DU145细胞中亚细胞定位通过核质分离实验及荧光原位杂交实验确定。(3)利用CCK-8增殖实验、克隆形成增殖实验和transwell迁移及侵袭实验分析circMAML3、miR-665及MAPK8IP2对前列腺癌细胞PC3和DU145功能的影响。(4)使用circBank和circular RNA Interactome预测circRNA可能靶向的miRNA,qRT-PCR检测PC3和DU145细胞中敲减circMAML3后miRNA表达变化,及过表达circMAML3后miR-665表达变化,Spearman分析circMAML3与miR-665在20例前列腺癌组织中的相关性,通过双荧光素酶报告基因实验、RNA免疫共沉淀实验及miRNA pulldown实验进一步分析circMAML3与miR-665在PC3和DU145细胞中关系。(5)使用DIANA-micro T、miRDB和ENCORI预测miRNA可能靶向的mRNA;通过UALCAN数据库分析可能靶向m RNA的表达情况及生存情况;qRT-PCR及Western blot检测转染miR-665 mimics/inhibitor后MAPK8IP2表达变化,通过双荧光素酶报告基因实验及miRNA pulldown实验进一步验证miR-665及MAPK8IP2的作用关系。(6)通过转染miR-665 mimics至过表达circMAML3的PC3细胞,及miR-665 inhibtor与circMAML3 si1共转染至DU145细胞,进行circMAML3与miR-665的回复实验,并使用Western blot检测miRNA靶基因表达变化。(7)Pearson分析circMAML3与MAPK8IP2在16例前列腺癌组织中的相关性;Western blot检测过表达和敲减circMAML3后对MAPK8IP2的影响;通过转染siMAPK8IP2至过表达circMAML3的PC3和DU145细胞进行回复实验,并使用Western blot检测MAPK8IP2表达变化。(8)将稳定敲减circMAML3的PC3细胞注射至裸鼠皮下,构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察敲减circMAML3后对PC3细胞在体内生长的影响;取瘤体组织进行qRT-PCR检测circMAML3、miR-665及MAPK8IP2表达情况,免疫组化实验分析Ki67和MAPK8IP2表达情况。研究结果:(1)从测序文件中筛选出在前列腺癌组织中高表达的circMAML3,circAtlas2.0数据库分析发现circMAML3在大多数癌组织中高表达;circMAML3在20对前列腺癌组织中的表达水平显著高于配对的正常组织;在前列腺癌细胞表达水平也明显高于正常前列腺上皮细胞。(2)PCR产物sanger测序检测到circMAML3环化位点,PCR产物琼脂糖凝胶电泳证实circMAML3在cDNA中可以检测到,而不存在于gDNA中;RNase R实验及放线菌素D实验表明circMAML3在前列腺癌细胞中稳定存在;核质分离实验及荧光原位杂交实验发现circMAML3主要分布Barasertib采购在细胞质中。(3)过表达circMAML3促进PC3和DU145细胞增殖、迁移及侵袭能力,敲减circMAML3抑制PC3和DU145细胞增殖、迁移及侵袭能力。通过预测结合qRT-PCR验证,circMAML3可能靶向miR-665,Spearman分析表明circMAML3与miR-665在前列腺癌组织中表达显著负相关,进一步双荧光素酶报告基因实验、RNA免疫共沉淀及miRNA pulldown实验证明circMAML3与miR-665存在直接作用关系。(4)miR-665 mimics抑制PC3和DU145细胞增殖、迁移及侵袭,miR-665inhibitor促进PC3和DU145细胞增殖、迁移及侵袭。预测结合qRT-PCR验证,miR-665可能靶向MAPK8IP2,双荧光素酶报告基因实验及miRNA pulldown实验证明miR-665与MAPK8IP2有直接作用关系。Western blot证明过表达circMAML3上调MAPK8IP2的表达明显受到miR-665 mimics的逆转,敲减circMAML3抑制MAPK8IP2的表达效应明显受到miR-665 inhibitor的回复。(5)MAPK8IP2高表达与不良临床病理因素和预后不佳相关,敲减MAPK8IP2抑制PC3和DU145细胞增殖、迁移及侵袭能力;Pearson分析表明circMAML3与MFerrostatin-1APK8IP2在前列腺癌组织中表达显著正相关,Western blot表明敲减和过表达circMAML3会下调或上调MAPK8IP2的表达;而敲减MAPK8IP2后可以回复过表达circMAML3导致的MAPK8IP2上调。(6)功能回复实验表明,miR-665 mimics可抑制circMAML3过表达对PC3细胞增殖、迁移及侵袭能力的促进作用,miR-665 inhibitor可回复敲减circMAML3对DU145细胞增殖、迁移及侵袭能力的抑制作用。与此同时,敲减MAPK8IP2可抑制circMAML3过表达对PC3和DU145细胞增殖、迁移及侵袭能力的促进作用。(7)裸鼠皮下成瘤实验证明,敲减circMAML3会抑制前列腺癌细胞体内生长Stirred tank bioreactor。研究结论:(1)circMAML3在前列腺癌组织及癌细胞中高表达,并促进前列腺癌恶性进展;(2)miR-665在前列腺癌组织及癌细胞中低表达,在前列腺癌中发挥抑癌作用;(3)MAPK8IP2高表达与不良的临床病理因素和不佳的预后密切相关,敲减MAPK8IP2可以减弱前列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力(4)miR-665通过靶向调控MAPK8IP2抑制前列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭;(5)前列腺癌细胞中circMAML3大部分位于细胞质中,circMAML3通过调控miR-665/MAPK8IP2轴促进前列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭。

目的:心肌梗死(Myocardial Infarction,MI)是由冠状动脉血流量减少、心脏组织供氧不足导致心肌细胞的不可逆死亡。由于心肌细胞几乎不具有再生潜力,抑制心肌细胞死亡对心肌梗死病人的预后尤为关键。近年来发现的铁死亡(Ferroptosis)是一种新型的铁依赖性细胞死亡方式,细胞死亡的同时伴随着脂质过氧化物的过量积累。目前,铁死亡被发现与多种疾病的发生发展密切相关,而铁死亡在心血管疾病中的关键作用也陆续引起人们的重视,但其具体参与机制尚未阐明。在心肌梗死的发生中,心肌细胞的钙超载被发现参与其中。细胞内钙超载的发生可激活钙调蛋白(Calmodulin,CaM)从而调控L型电压依赖性钙通道(L-type voltage-dependent Ca~(2+)channel,LVDCC)的作用。鉴于细胞内铁超载是引发心肌细胞铁死亡的重要机制,而LVDCC是参与细胞内铁离子运输的重要阳离子通道,我们意图探究心肌梗死过程中Ca~(2+)/CaM的激活是否可以通过调控LVDCC通道造成铁过载从而加剧铁死亡的发生。方法:建立大鼠心肌细胞系H9c2缺氧(Hypoxia)模型,使用铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1,Fer-1)和去铁胺(Deferoxamine,DFO)进行干预,Cell counting kit8(CCK-8)法和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色检测细胞活性和死亡率;分光光度法检测心肌丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量;蛋白质印迹法(Western blot)检测溶质载体家族7成员11(Solute Carrier Family 7 Member 11,SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化酶4(Glutathione peroxidaselleck合成se 4,GPX4)表达量变化。随后使用Fluo-4/AM荧光探针检测缺氧对细胞内Ca~(2+)水平的影响,Western blot和实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测CaM蛋白和m RNA表达水平以及钙调蛋白激酶(Ca~(2+)/calmodulin-dependent protein kinases,CaMKs)包括CaMKⅡ和CaMKIV的表达。此外,通过抑制CaM检测心肌细胞活性及铁死亡相关指标。并进一步使用钙黄绿素(Calcein-AM)荧光探针和总铁离子比色法试剂盒,检测阻断LVDCC对缺氧诱导下心肌细胞内铁离子水平的影响。最后建立MI模型,测定心功能和心肌纤维化水平,以及CaM的表达变化;同时对MI术后小鼠进行CaM拮抗剂(Calmidazolium chloride,CCL)治疗,在心肌组织中检测铁死亡相关指标。结果:在细胞水平上,与对照组相比,Hypoxia组细胞存活率、GSH含量以及SLC7A11和GPX4表达下降,细胞死亡率和MDA含量增加;与Hypoxia组相比,Fer-1和DFO处理均在不同程度上抑制了缺氧给予的H9c2细胞损伤。H9c2细胞经缺氧诱导后,表现为Ca~(2+)浓度上升、CaM以及CaMKⅡ和CaMKIV表达上调。进一步通过细胞活性以及检测铁死亡相关指标发现,CaM拮抗剂CCL或敲低CaM均能缓解Gefitinib-based PROTAC 3缺氧诱导的心肌细胞铁死亡。Calcein-AM和细胞总铁检测的结果显示,LVDCC阻滞剂维拉帕米抑制缺氧导致的铁离子增多,提示CaM通过调控LVDCC打开并造成细胞内铁过载从而诱发铁死亡。在动物水平,进一步证明CaM通过调控LVDCC打开在铁死亡介导的MI中发挥重要作用。结论:本研究在细胞水平证实了铁死亡是缺氧损伤中心肌细胞重要的死亡方式,并揭示了Ca~(2+)/CaM及其调控LVDCC可能作为抑制铁死亡的新靶点,并在动物水平进行验证immune tissue,为进一步阐明其机理和扩大其应用提供参考。

骨肉瘤(OS)是儿童和青少年中最常见的原发性骨肿瘤,具有很高的局部浸润和转移倾向,其发病机制与基因、年龄、性别、primary endodontic infection身高、激素等多种因素有关。尽管手术与化疗相结合极大地改善了骨肉瘤患者的预后,但转移性或复发性骨肉瘤的预后仍然不令人满意。因此探究骨肉瘤的发病机制、寻找有效治疗靶点、进行针对性的靶向精准治疗是目前的当务之急。在哺乳动物体内,硫化氢(H_2S)主要通过酶促途径产生,涉及三种酶:胱硫醚β-合成酶(CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(CSE)以及3-巯基丙酮酸转硫酶(3-MST)。研究表明,H_2S在肿瘤发生发展中具有“双刃剑”作用,这与H_2S的浓度有关。因此,可通过内源性调节H_2S合成酶的表达来改变H_2S的浓度,进而探究H_2S对肿瘤生长的影响情况。虽然H_2S在多种肿瘤中的作用已有大量研究,但H_2S在骨肉瘤细胞中发挥的作用及其机制仍不清楚。本论文旨在探究过表达/敲低CBS基因后对骨肉瘤细胞生长的影响及其作用机制。为了确定H_2S在骨肉瘤细胞中是否发挥作用,首先通过ELISA实验检测了人正常成骨细胞系h FOB1.19和五种骨肉瘤细胞系(143B、SJSA-1、HOS、MG63、U2OS)中的H_2S含量,结果表明,骨肉瘤细胞系尤其是143B和HOS细胞中的H_2S含量显著高于人正常成骨细胞系,据此推测H_2S在骨肉瘤细胞系中可能发挥一定的作用。通过q PCR实验和Western blot实验分别从m RNA水平和蛋白水平检测了三种H_2S合成酶在人正常成骨细胞系和五种骨肉瘤细胞系中的表达情况。结果显示,CBS在五种骨肉瘤细胞系中的m RNA和蛋白水平均高于人正常成骨细胞系,因此,选用CBS表达最高的143B和HOS细胞作为研究对象进行后续研究。为探究CBS在骨肉瘤细胞系中的作用,进行了稳定过表达/敲低CBS的骨肉瘤细胞的构建。将构建好的慢病毒载体感染骨肉瘤143B和HOS细胞,经嘌呤霉素筛选,杀死未感染成功的细胞,利用荧光显微镜观察细胞的荧光效果并通过q PCR实验和Western blot实验检测CBS的表达情况,来验证细胞是否感染成功,确保获得稳定过表达/敲低CBS的骨肉瘤细胞。对成功构建的细胞及正常未感染的细胞进行了如下两大分组:(1)过表达CBS的细胞分组:正常组(Control)、过表达阴性对照组(Mock)以及过表达组(CBS);(2)敲低CBS的细胞分组:正常组(Control)、敲低阴性对照组(sh-Scb)、敲低组(sh-CBS-1和sh-CBS-2)。其中,与Control组相比,Mock组和sh-Scb组的CBS表达无明显差异,CBS组的CBS含量升高,sh-CBS-1组和sh-CBS-2组的CBS水平降低。在体外通过一系列细胞功能实验和分子实验检测内源性H_2S合成酶CBS对骨肉瘤细胞生长的影响及作用机制。MTT实验和CCK-8实验表明过表达CBS促进骨肉瘤细胞存活,敲低CBS抑制细胞存活;Tunel实验检测细胞凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白和焦亡相关蛋白的表达水平,得知过表达CBS能够抑制骨肉瘤细胞发生凋亡和焦亡,敲低CBS则作用相反。Ed U实验、平板克隆实验和软琼脂集落形成实验证明过表达CBS增强骨肉瘤细胞的增殖能力、克隆形成和集落形成能力Apoptosis抑制剂;敲低CBS则抑制骨肉瘤细胞的增殖、克隆和集落形成。通过划痕实验和Transwell实验、Invasion实验研究了CBS对骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力的影响,并通过Western blot检测EMT相关蛋白,得知过表达CBS促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭,敲低CBS则发挥抑制作用。本论文也进行了作用机制的探讨,推测mi R-3918靶向CBS可能通过ROS介导的NF-κB信号通路促进骨肉瘤细胞的生长。在体内通过建立骨肉瘤裸鼠移植瘤模型,采用小动物活体成像技术实时监测各组肿瘤的生长情况。免疫组化染色检测各组肿瘤的Ki67、CD31、Cleaved caspase-3、Cleaved GSDMD、Vimentin、p-p65等Puromycin试剂指标。结果表明,过表达CBS促进肿瘤增殖、血管生成、侵袭,抑制肿瘤死亡,加快肿瘤的生长;敲低CBS则相反。综上所述,体外实验和体内实验共同说明,mi R-3918靶向CBS可能通过ROS介导的NF-κB信号通路促进骨肉瘤细胞的存活、增殖、克隆、集落形成、迁移和侵袭,抑制细胞的死亡,从而发挥促进骨肉瘤细胞生长的作用。

研究背景:1.化疗抵抗是影响胃癌预后的重要原因2020年世界卫生组织发表数据显示:胃癌是世界范围内第五大常见恶性肿瘤和第四大恶性肿瘤相关死亡原因。目前,以化疗为主的综合治疗是主要治疗手段,然而胃癌患者的5年生存率仍低于30%,化疗抵抗可能是重要影响因素。因此,探索化疗抵抗的关键机制,并寻求有效的应对药物是当前工作的重中之重。2.衰老肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)促进胃癌化疗抵抗形成,M2型肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)与免疫抑制和化疗抵抗密切相关CAFs是肿瘤微环境中最主要的基质细胞。研究表明,化疗在杀伤癌细胞的同时,可以引发CAFs发生衰老,所产生的衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)可以促进化疗抵抗的发生。TAMs是肿瘤微环境中重要的免疫细胞,在肿瘤早期以抑瘤作用的M1型为主,中晚期以促瘤作用的M2型为主。最新报道,M2型TAMs具有免疫抑制以及促进化疗抵抗的作用。那么,肿瘤微环境中各种细胞相互作用、互相影响,衰老CAFs是否可以促进TAMs细胞向M2型极化,从而增强免疫抑制?这一问题有待研究。3.扶正解毒方是提高胃癌化疗疗效的有效方剂,其机制需要进一步明确扶正解毒方(后研发为院内扶正解毒口服液)是我院肿瘤科用于治疗胃癌的院内制剂。前期研究显示,扶正解毒方可以增加化疗完成率,使胃癌Ⅲ期患者的5年生存率提高9.1%。另动物实验表明,扶正解毒方联合化疗干预胃癌模型小鼠,治疗效果显著优于单纯化疗组,其机制可能与调控肿瘤微环境中TAMs从M2型向M1型极化,降低免疫抑制因子IL-10、IL-13和TGF-β的表达有关。然而,扶正解毒方是否可以通过调控衰老CAFs改善免疫抑制和化疗抵抗尚待明确。综上,本课题从“胃癌细胞—衰老CAFs细胞—TAMs细胞”入手,探讨衰老CAFs引起免疫抑制和化疗抵抗的新机制,以及扶正解毒方的干预作用,旨在为临床selleck抑制剂上解决胃癌化疗抵抗这一瓶颈问题提供助力。研究目的:1.体外借助衰老CAFs细胞模型,基于p38MAPK/MK2通路和MeCP2/NOX4/PKM2通路,观察衰老CAFs对免疫抑制以及化疗抵抗的促进作用,以及扶正解毒方的干预机制。2.体内借助衰老CAFs/胃癌细胞共接种小鼠模型,验证扶正解毒方通过调控“胃癌细胞—衰老CAFs细胞—TAMs细胞”,改善免疫抑制和化疗抵抗的作用机制。研究方法:1.衰老CAFs高表达SASP及扶正解毒方干预作用研究应用团队前期构建的衰老CAFs模型,采用MRC-5人胚肺成纤维细胞,设置对照组、衰老CAFs模型组、空白血清组、含药血清组,运用ELISA、RT-PCR以及免疫荧光技术,对SASP相关因子—IL-8、TGF-β、WNT16B进行检测,同时观察扶正解毒方含药血清的干预作用。2.衰老 CAFs 条件培养基(conditioned medium,CM)诱导 M2 型 TAMs极化及扶正解毒方干预作用研究运用PMA将THP-1人单核细胞诱导为TAMs细胞;按照团队前期探索的方法提取衰老CAFs的CM,并用其培养TAMs细胞,设置对照组、衰老CAFs-CM组、空白血清组、含药血清组,借助流式细胞术、RT-PCR、免疫荧光技术,检测M2型TAMs细胞标志物CD206的表达水平;同时观察扶正解毒方含药血清对M2型TAMs极化的干预作用;另基于p38MAPK/MK2通路,运用RT-PCR、Western blot方法对作用机制进行探讨。3.衰老CAFs-CM促MKN-45胃癌细胞化疗抵抗及扶正解毒方干预作用研究应用衰老CAFs的CM培养MKN-45胃癌细胞,设置对照组、化疗组、衰老CAFs-CM组、衰老CAFs-CM+化疗组、空白血清组、含药血清组,通过CCK-8法、细胞划痕、平板细胞克隆等实验探讨衰老CAFs-CM对胃癌细胞化疗敏感性的影响;并观察扶正解毒方对衰老CAFs-CM引起化疗抵抗的干预作用。在此基础上,利用RT-PCR、Western blot等方法,基于MeCP2/NOX4/PKM2通路探讨扶正解毒方发挥作用的机制。4.扶正解毒方对衰老CAFs/胃癌细胞共接种小鼠模型干预作用及TAMs调控机制研究采用25只CB17-SCID免疫缺陷小鼠,分别单纯接种胃癌细胞、混合接种衰老CAFs/胃癌细胞,给予5-FU和(或)扶正解毒方进行干预。具体分组为对照组、5-FU组、混合接种组、混合接种+5-FU组、混合接种+5-FU+中药组,干预14天后取材,检测以下指标:(1)小鼠瘤重、瘤体积、抑瘤率;运用RT-PCR、Western blot方法,检测MeCP2/NOX4/PKM2通路的mRNA和蛋白表达水平。(2)运用ELISA、RT-PCR方法,检测小鼠血清和瘤组织中衰老相关分泌因子IL-8、TGF-β、WNT16B的表达水平。(3)运用流式细胞术、免疫荧光方法,检测小鼠脾脏和瘤组织中M2型TAMs表达情况。结合RT-PCR、Western blot方法,检测p38MAPK/MK2通路mRNA和蛋白表达水平。研究结果:1.衰老CAFs高表达SASP及扶正解毒方干预作用研究ELISA、RT-PCR、免疫荧光结果显示:(1)与对照组相比,衰老CAFs组SASP相关因子—IL-8、TGF-β、WNT16B处于高表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05),说明衰老CAFs高表达SASP因子。(2)与空白血清组相比,扶正解毒方含药血清可以明显抑制衰老CAFs细胞SASP相关因子—TGF-β、WNT16B的表达,差异具有统计学意义(P<0.05);同时,虽然含药血清组的IL-8表达水平低于空白血清组,但无统计学差异(P>0.05),说明扶正解毒方含药血清可以降低SASP因子的表达水平。2.衰老CAFs-CM诱导M2型TAMs极化及扶正解毒方干预作用研究(1)流式细胞术、免疫荧光、RT-PCR结果显示:①与对照组相比,衰老CAFs-CM组的M2型TAMs细胞标志物CD206处于高表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05),说明衰老CAFs可以诱导TAMs细胞向M2型极化,增强免疫抑制。②与空白血清组相比,扶正解毒方含药血清可以降低CD206的表达水平(P<0.05),逆转TAMs细胞向M2型极化,改善免疫抑制。(2)RT-PCR、Western blot结果显示:与空白血清组相比,扶正解毒方含药血清可以降低p38MAPK、MK2的表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05),提示扶正解毒方逆转TAMs细胞向M2型极化,改善免疫抑制的机制与调控p38MAPK/MK2通路有关。3.衰老CAFs-CM促MKN-45胃癌细胞化疗抵抗及扶正解毒方干预作用研究(1)CCK-8实验、平板细胞克隆形成实验、划痕实验结果显示:①与5-FU组相比,衰老CAFs-CM+5-FU组的肿瘤细胞抑制率明显降低、肿瘤细胞克隆数明显增多、肿瘤细胞迁移率明显提高,差异具有统计学意义(P<0.05),说明衰老CAFs降低了化疗药5-FU的治疗效果,促进了化疗抵抗形成。②与空白血清组相比,扶正解毒方含药血清可以提高肿瘤细胞抑制率、减少肿瘤细胞Immune repertoire克隆数、降低肿瘤细胞迁移率,差异具有统计学意义(P<0.05),提示扶正解毒方可以缓解由衰老CAFs引起的化疗抵抗。(2)RT-PCR、Western blot结果显示:与空白血清组相比,扶正解毒方含药血清可以降低MeCP2、NOX4、PKM2的表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05),提示扶正解毒方改善化疗抵抗的机制与调控MeCP2/NOX4/PKM2通路有关。4.扶正解毒方对衰老CAFs/胃癌细胞共接种小鼠模型干预作用及TAMs调控机制研究4.1衰老CAFs对化疗敏感性的影响及扶正解毒方干预作用研究(1)瘤重、瘤体积、抑瘤率结果显示:①相较于单纯接种胃癌细胞各组(对照组、5-FU组),混合接种各组(混合接种组、混合接种+5-FU组)的瘤重、瘤体积明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),说明衰老CAFs具有促瘤作用。②相较于“5-FU组”,“混合接种+5-FU组”的瘤重、瘤体积明显增大(P<0.05,差异有统计学意义),抑瘤率明显下降,说明衰老CBIBW2992分子式AFs可以引起化疗抵抗。③与“混合接种+5-FU组”相比,“混合接种+5-FU+中药组”小鼠的瘤重和瘤体积明显变小(P<0.05,差异有统计学意义)、抑瘤率显著提高,差异具有统计学意义,提示扶正解毒方可以改善由衰老CAFs引起的化疗抵抗。(2)RT-PCR、Western blot结果显示:相较于“混合接种+5-FU组”,“混合接种+5-FU+中药组”小鼠的瘤组织中MeCP2、NOX4、PKM2表达水平下降,差异具有统计学意义(P<0.05),从体内印证扶正解毒方改善化疗抵抗的机制与调控MeCP2/NOX4/PKM2通路有关。4.2 SASP相关因子检测及扶正解毒方干预作用研究ELISA和RT-PCR结果显示:(1)在小鼠血清中,相较于“5-FU组”,“混合接种+5-FU组”TGF-β、IL-8处于高表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。在小鼠瘤组织中,相较于“5-FU组”,“混合接种+5-FU组”IL-8、TGF-β、WNT16B均处于高表达水平(P<0.05),说明联合接种衰老CAFs细胞后,小鼠体内SASP因子处于高表达水平。(2)与“混合接种+5-FU组”相比,“混合接种+5-FU+中药组”小鼠的血清和瘤组织中IL-8、TGF-β、WNT16B的表达水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),说明扶正解毒方可以改善由衰老CAFs引起的SASP高表达。4.3 M2型TAMs表达情况及扶正解毒方干预作用研究(1)流式细胞术和免疫荧光结果显示:①相较于单纯接种胃癌细胞组(即对照组、5-FU组),混合接种各组(混合接种组、混合接种+5-FU组、混合接种+5-FU+中药组)小鼠脾脏中CD206的表达水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05),说明联合接种衰老CAFs细胞后,小鼠体内M2型TAMs细胞表达水平明显升高,增强免疫抑制。②与“混合接种+5-FU组”相比,“混合接种+5-FU+中药组”小鼠的脾脏和瘤组织中CD206明显降低(P<0.05),说明扶正解毒方可以改善由衰老CAFs引起的M2型TAMs细胞极化,缓解免疫抑制。(2)RT-PCR、Western blot结果显示:相较于“混合接种+5-FU组”,“混合接种+5-FU+中药组”小鼠的瘤组织中p38MAPK和MK2表达水平下降,差异具有统计学意义(P<0.05),从体内印证扶正解毒方改善M2型TAMs细胞极化,缓解免疫抑制的机制与调控p38MAPK/MK2通路有关。研究结论:1.衰老CAFs存在衰老相关分泌因子(WNT16B、IL-8、TGF-β)高表达;扶正解毒方可下调衰老相关分泌因子(WNT16B、IL-8、TGF-β)的表达。2.衰老CAFs可以引起TAMs细胞高表达CD206,促进其向M2型TAMs细胞极化,增强免疫抑制;扶正解毒方可降低TAMs细胞CD206的表达水平,改善由衰老CAFs引起的M2型TAMs细胞极化,缓解免疫抑制,其机制与调控p38MAPK/MK2通路有关。3.衰老CAFs可降低胃癌细胞对化疗药物5-FU的治疗效果,促进化疗抵抗形成;扶正解毒方可改善由衰老CAFs引起的胃癌细胞对5-FU的化疗抵抗,其机制与调控MeCP2/NOX4/PKM2通路有关综上,扶正解毒方可以通过对肿瘤微环境中“衰老CAFs-TAMs细胞-胃癌细胞”发挥调控作用,改善免疫抑制以及化疗抵抗。

豌豆prognosis biomarker生产中面临连作障碍，严重影响其产量和品质，CL13900配制但其发生机理未被完全揭示。化感物质引发的自毒效应是连作障碍发生的重要原因之一，为了给进一步研究豌豆化感物质在豌豆连作障碍的作用提供参考。以不同基因型豌豆定豌10号、云豌8号为指示品种，对其苗期的根茎叶浸提液进行了气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析，以明确豌豆不同器官中化感物质的差异。结果表明，云豌8号不同器官中化合物种类均高于定豌10号。2种豌豆的地BIBW2992核磁上部器官中化合物种类多于根系。不同器官中相对含量较高的化感物质种类存在差异。其中，抗氧化剂2246除定豌10号的叶片浸提液外，在2种豌豆的不同器官浸提液中均存在。此外，棕榈酸和芥酸酰胺在云豌8号的不同器官浸提液中均存在，肉桂酸仅在定豌10号茎浸提液中存在。综上，豌豆不同器官浸提液中均存在化感物质，但其种类因器官类型和豌豆基因型而异。

目的：探究铁调素等铁代谢指标和相关红细胞参数在诊断缺铁性贫血中的作用。方法：将本院2019年1月至2022年12月收治的贫血患者作为研究对象，将贫血患者根据贫血ocular pathology类型分为缺铁性贫血组72例，慢性病贫血组72例，再纳入72例同期健康体检者作为对照组，分析三组受检者铁selleck抑制剂调素等铁代谢指标和相关红细胞参数。结果：缺铁性贫血组患者血红蛋白（Hb）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、网织红细胞百分比（REselleck Liproxstatin-1T）、未成熟网织红细胞比率（IFR）、铁调素（Hepcidin）、总铁结合力（TIBC）、血清铁（SF）指标和对照组、慢性贫血组患者相比，差异显著（P<0.05）。结论：铁调素等铁代谢指标和相关红细胞参数对缺铁性贫血的诊断效果显著，能够对不同贫血类型进行鉴别，值得研究和推广。

目的:CL13900临床试验本研MK-2206分子量究通过回顾性分析老年冠心病合并缺铁性贫血患者的临床资料,对其中医证型和用药规律进行总结,为中医辨证治疗老年冠心病合并缺铁性贫血提供思路与参考。方法:收集2013年1月至2022年12月于山东中医药大学附属医院住院的符合诊断的患者的临床资料,统计其中医证型及处方用药情况,运用中医传承辅助平台(V2.5)软件分析其中医证型分布及组方用药规律。结果:1老年冠心病合并缺铁性贫血患者的一般情况共收集老年冠心病合并缺铁性贫血患者共207例,其中男性85例(占41.06%),女性122例(占58.94%);轻度贫血患者90例(占43.48%),中度贫血患者97例(占46.86%),重度贫血患者20例(占9.66%),极重度贫血患者0例;患者年龄分布在60-103岁之间,平均年龄79.51岁,其中60-69岁患者45例(占21.74%),70-79岁患者48例(占23.19%),80-89岁患者72例(占34.78%),≥90岁患者42例(占20.29%),高龄老人共114例(占55.07%)。2老年冠心病合并缺铁性贫血患者的中医证型分布患者的中医证型按降序排列依次为气血亏虚证、气虚血瘀证、气阴两虚证、痰浊内阻证、心血瘀阻证、阳气虚衰证。3老年冠心病合并缺铁性贫血患者的用药规律研究207例老年冠心病合并缺铁性贫血患者中,有169人服用中药汤剂,中药使用率达81.64%,涉及中药251味。药物使用频次排序前20位的中药依次为当归、黄芪、甘草、茯苓、炒白术、麦冬、党参、生地黄、川芎、陈皮、白芍、牛膝、桃仁、炙甘草、赤芍、五味子、清半夏、丹参、红花、黄芩;在药物功效分布上排在前6类的依次为补虚类、活血化瘀类、化痰止咳平喘类、理气类、清热类、利水渗湿类;四气分布中温出现频次最高,其次是寒、平、凉、热;五味中甘味出现频次最高,其次是苦、辛、酸、咸、涩;归经中出现频次最高的是脾经,其次是肺经、肝经、心经、胃经、肾经、大肠经、胆经、膀胱经、小肠经、心包经、三焦经。使用关联规则的分析方法,得到前10位的药物组合为黄芪-当归、川芎-当归、炒白术-茯苓、党参-当归、党参-黄芪、黄芪-茯苓、当归-茯苓、生地黄-当归、陈皮-茯苓、党参-茯苓。关联molecular and immunological techniques度高频的前5组药对(组)分别为红花-川芎->当归,红花-桃仁->当归,红花->当归,川芎-黄芪-当归,红花-当归->川芎。结论:1老年冠心病合并缺铁性贫血为本虚标实,虚实夹杂之证。本虚可见气血阴阳亏虚,其中以气血亏虚为主,标实以血瘀、痰浊多见。2老年冠心病合并缺铁性贫血的治疗以补虚为本,祛实为标,补虚多以甘温之品补益气血,调和阴阳;祛实多以活血、化痰、理气、清热、利湿之药化瘀降浊,行气除湿。

目的 探讨儿童保健门诊婴幼儿营养性缺铁性贫血的临床效果及满意度。方法 选取2020年4月—2021年12月福清市妇幼保健院门诊收治的80例婴幼儿营养性缺铁性贫血患儿作为研究对象，用随机数字表法将其分对照组和观察组，各40例，对照组接受铁剂治疗，观察组接受铁剂治疗+儿童保健门诊，比较两组患儿治疗疗效、症状改善时间、生化指标、满意度等。结果 观察组治疗总有效率（97.50%）高于对照组（75.00%），Zinc-based biomaterials差异有统计学意义（P <0.05）。观察组患儿饮食恢复正常时间、血红蛋白恢复正常时间、网织红细胞改善时间短于对照组，差异有统计学意义（P <0.05）。生化指标比较，治疗前组间数据差异无统计学意义（P>0.05），治疗后，观察组MCHC、MCV、Hb、铁蛋白、血清铁高于对照组，差CL 318952 IC50异有统计学意义（P <0.05Smoothened Agonist供应商）。观察组家属治疗满意度（92.50%）高于对照组（72.50%），差异有统计学意义（P <0.05）。结论 临床治疗婴幼儿营养性缺铁性贫血，可在补充铁剂的基础上，再给予儿童保健门诊，能促进症状改善，提升治疗疗效和满意度。

目的:探讨泛素特异性蛋白酶7(USP7)调节Mdm2 p53结合蛋白同源物(MDM2)-p53轴对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法:Western blot检测人子宫内膜癌组织、癌旁组织、人子宫内膜上皮细胞hEEC及人子宫内膜癌细胞系Ishikawa、HEC-1-A、KLE中USP7蛋白表达。将Ishikawa细胞分为NC组、P22077(USP7抑制剂)组、pcDNA组、pcDNA-MDM2组、P22077+pcDNA组、P22077+pcDNA-MDM2组，CCK-8法和克隆形成实验检测Ishikawa细胞增殖；流式细胞术检测Ishikawa细胞凋亡与细胞周期变化；Western blot检测Ishikawa细胞中USP7、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、周期素依赖性激酶2(CDK2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、MDM2、p53蛋白表达。以RG7388(MDM2抑制剂)或PFT-α(p53抑制剂)与20μmol/selleckchem LY294002L P22077共处理Ishikawa细胞48 h以验证USP7-MDM2-p53信号轴上下游关系。结果:USP7蛋白在子宫内膜癌组织和细胞中高表达，且Ishikawa细胞中USP7蛋白表达量最高，因此，选择Ishikawa细胞为研究对象。与NC组比较，P22077组Ishikawa细胞OD_(450)值、克隆形成率、S期和G_2/M期细胞数、USP7、CyclinD1、CDK2、MDM2蛋白表达降低，细胞凋亡率、G_0/G_1期细胞数、p53、Bax蛋白表达升高(P<0.05);与NC组、pcDNA组比较，pcDNA-MDM2组Ishikawa细胞OD_(450)值、克隆形成率、S期和G_2/M期细胞数、USP7、CyclinD1、CDK2、MDM2蛋白表达升高，细胞凋亡率、G_0/G_1期细胞数、p53、Bax蛋白表达降低(P<0.05);与P22077组、P22077+pcDNA组比较，P22077+pcDNA-MDM2组Ishikawa细胞OD_(450)值、克隆形成率、S期和G_2/M期细胞数、USP7、CyclinD1、CDK2、MDM2蛋白表达升高，细胞凋亡率、G_0/G_1期细胞数、p53、Bax蛋白表达降低(P<0.05)。p53为USP7-MDM2通路下游分子。结论:抑制USP7表达可能通过下调MDM2来激活p53进而抑制genetic obesityIshikawa细胞增殖BI 10773试剂、促进细胞凋亡及周期停滞。

青稞茶(Highland barley tea,HBT)是以青稞籽粒为原料经烘烤后制成的一种谷物茶,富含天然活性成分,长期饮用能有效降低代谢性疾病的患病风险。目前我国已经正式步入老龄化社会,老年个体广泛出现机体器官功能退化并由此产生慢性代谢疾病,其中骨骼肌功能的衰退严重影响了老年人的生活质量,并制约了社会经济发展。因此探究HBT对老Two-stage bioprocess年人群骨骼肌健康的影响对改善老年人群的健康状态和减轻社会医疗负担具有重要的科学和社会意义。本论文拟通过自然衰老小鼠模型探究长期饮用HBT对骨骼肌衰老的影响,结合体外骨骼肌衰老细胞模型对潜在的功能性组分进行筛选,利用分离纯化及质谱技术对功能组分进行富集、鉴定及活性分析;通过动物和细胞模型www.selleck.cn/products/Etopophos探究功能组分抑制骨骼肌衰老的潜在分子机制;最后利用分子生物学技术对小鼠骨骼肌中潜在调控基因进行鉴定并对其进行特异性敲除,最终明确HBT改善骨骼肌衰老的作用机制。主要研究内容如下:(1)探究长期饮用HBT对衰老小鼠生理状态以及骨骼肌功能的影响。用HBT替代饮用水对自然衰老小鼠进行持续时间为5个月的长期干预,之后对小鼠基础生理指标、炎症、血浆代谢物、骨骼肌功能及运动能力进行测定,探究长期饮用HBT对小鼠衰老的影响。结果表明长期饮用HBT可以降低衰老小鼠的体重和脾脏的重量,增加骨骼肌的体重占比并降低小鼠血浆炎症水平。血浆中线粒体标志物短链酰基肉碱以及部分氨基酸含量增加,部分胆汁酸及长链酰基肉碱的含量降低。衰老小鼠腓肠肌中纤维化的水平受到抑制,I型肌纤维的比例增加进而提升小鼠的耐力。因此,长期饮用HBT可以降低衰老小鼠炎症水平和缓解线粒体损伤,增加骨骼肌线粒体活性和运动能力。(2)通过体外模型对HBT调节骨骼肌衰老的潜在组分进行鉴定及活性探究。利用棕榈酸(PA)处理小鼠骨骼肌成肌细胞(C2C12),构建小鼠骨骼肌体外线粒体损伤的衰老模型。以LC-MS测定的酰基肉碱相对表达水平和Seahorse检测的细胞线粒体呼吸能力为重要依据,验证细胞模型的有效性。将HBT茶汤分为了醇溶(AS)和水溶(WS)两个组分,对两个组分的基本成分及体外抗氧化活性进行测定,并通过骨骼肌体外线粒体损伤模对AS和WS的骨骼肌线粒体损伤的调节作用进行研究。结果表明,AS主要成分为多酚黄酮为主的小分子化合物,WS的主要成分为可溶性碳水化合物。因此,AS展现出更高的抗氧化活性,并能有效缓解PA诱导的骨骼肌线粒体损伤。进一步研究发现,AS可以通过AMPK/SIRT3/Fox O3a通路抑制细胞内蛋白的乙酰化水平、线粒体氧化损伤和线粒体介导的细胞凋亡。基于以上结果明确酚类物质是HBT调节骨骼肌衰老的功能组分。(3)对HBT中酚类物质进行富集、纯化、定性以及定量分析,并对其线粒体调节活性进行探究。通过大孔吸附树脂结合动态吸附对青稞茶粗多酚(CHBP)进行纯化,利用UPLC-TOF-MS对纯化后的多酚进行定性和定量分析,并探究酚类物质的活性。结果显示,经AB-8大孔吸附树脂动态吸附纯化后,青稞茶酚类物质(HBP)总酚含量大幅度提高,纯化后酚类物质中鉴定出28种酚类物质单体。定量结果显示原花青素B3是纯化多酚中含量最多的化合物,其次是没食子酸、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、表儿茶素、咖啡酸、对香豆酸、丁香酸、阿魏酸、苯甲酸、芦丁、山奈酚、儿茶素以及木犀草素。线粒体调节活性结果显示HBP、CHBP、原花青素B3可以缓解PA诱导的线粒体损伤,儿茶素、原儿茶酸、对香豆酸、阿魏酸可以改善线粒体的部分功能,其中HBP活性高于CHBP以及单体多酚。(4)探究不同剂量HBP对衰老引起的肌萎缩和晚期糖基化终末产物(AGEs)的抑制作用,探究衰老进程中AGEs对骨骼肌的影响。结果表明,D-半乳糖诱导的衰老会增加小鼠血清和比目鱼肌中AGEs的含量,降低比目鱼肌质量和线粒体功能蛋白SIRT3表达,并增加肌萎缩相关基因Atrogin-1的表达。中高剂量的HBP干预可以有效缓解上述情况,降低衰老小鼠体内氧化应激的水平。进一步研究发现,AGEs可以降低C2C12细胞中去乙酰化酶3(SIRT3)的表达,导致肌萎缩和线粒体氧化应激,而HBP能够有效抑制体外与体内AGEs的生成,且抑制率与HBP浓度呈正相关。中高剂量HBP可以通过抑制AGEs形成从而缓解骨骼肌的衰老。此外明确了HBP动物实验的最佳干预浓度为100 mg/kg/bw。(5)探究HBP对衰老Emricasan引起的骨骼肌纤维化的影响,并明确潜在介导的基因。利用D-半乳糖和骨骼肌钝挫伤构建体内和体外骨骼肌纤维化模型,进一步探究HBP对衰老引起的骨骼肌纤维化的作用及潜在机制。结果表明,D-半乳糖会增加小鼠骨骼肌衰老及纤维化相关指标,包括氧化应激水平、β-半乳糖苷酶含量、炎症水平、细胞乙酰化水平、以α-SMA为代表的骨骼肌纤维化标记物表达水平等,并降低SIRT3的表达。而HBP的干预可以有效缓解D-半乳糖诱导的骨骼肌细胞衰老及纤维化。值得注意的是,C2C12细胞中的SIRT3被沉默后会加剧D-半乳糖诱导的骨骼肌损伤及纤维化,并且HBP的干预效果也降低,表明SIRT3是介导HBP改善骨骼肌衰老及纤维化的重要基因。(6)探究SIRT3介导HBP的对骨骼肌衰老的影响。通过基因编辑与重组技术,构建骨骼肌SIRT3特异性敲除小鼠(mSIRT3 KO)。对成年后小鼠体重及骨骼肌相关指标进行测定发现,成年后mSIRT3 KO小鼠的体重降低,腓肠肌及比目鱼肌质量减少,腓肠肌纤维类型由氧化型肌纤维(I型)向糖酵解肌纤维(II型)转化,肌萎缩及纤维化相关基因的表达水平增加,小鼠力量及耐力降低,炎症及氧化应激水平增加。HBP的干预无法缓解骨骼肌特异性敲除SIRT3造成的骨骼肌衰老,但可以部分缓解炎症。结果表明SIRT3在调节骨骼肌衰老过程具有重要作用,是介导HBP抑制骨骼肌衰老的重要基因。综上所述,青稞中的酚类物质是青稞茶调节骨骼肌衰老的重要功能组分,可以通过抑制AGEs、炎症以及氧化应激等多种途径缓解骨骼肌衰老,其中SIRT3在调节骨骼肌衰老过程中具有重要作用。本研究为青稞资源的高效利用以及谷物健康饮品的研发提供了新思路与理论支持。