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研究背景:补骨脂是临床常用的补益类中药,具有补肾壮阳,温脾止泻等功效,多用于治疗肾虚阳痿、腰酸冷痛、骨质疏松等多种疾病,然而,近年来补骨脂及其相关制剂导致肝损伤不良反应的事件频繁发生。课题组前期通过大量的临床病例和基础研究,证明了补骨脂可导致特异质肝损伤,且具有免疫特异质属性。但是,迄今补骨脂致特异质损伤的易感物质及作用机制尚不清楚,难以形成有针对性的补骨脂安全用药风险防控策略。为此,本文拟对补骨脂特异质肝损伤的物质基础和作用机制开展探索性研究,以期为科学制定补骨脂及其相关制剂肝损伤风险防控策略提供参考依据。研究目的:本研究旨在探索补骨脂特异质肝损伤的主要易感物质及selleck作用机制,并根据相应的成因机制制定补骨脂安全用药风险防控策略。研究方法:1.基于小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs),构建LPS诱导的体外炎症小体激活模型,筛选补骨脂特异质肝损伤易感成分。采用Western Blot(WB)技术检测补骨脂中活性成分对炎症小体激活相关蛋白caspase-1 p20表达的影响、以酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测炎症小体激活下游炎症因子IL-1β、TNF-α的含量。2.建立LPS诱导的小鼠免疫应激模型,对比易感成分在正常状态及免疫应激状态下导致肝损伤的情况。以赖氏法、ELISA、QRT-PCR法测定血清中AST、ALT、IL-1β、TNF-α和肝脏IL-1β、IL-18、TNF-α含量,采用WB技术检测小鼠肝脏组织中caspase-1 p20蛋白表达,进一步地,利用H&E染色法观察各组小鼠肝脏病理学变化。3.在LPS诱导的炎症小体活化模型基础上,分别用药理学(NLRP3拮抗剂MCC950、NLRC4拮抗剂echinatin、AIM2拮抗剂ODN)和遗传学(Nlrp3基因敲除、靶向干扰Aim2基因)阻断/敲除/干扰NLRP3、NLRC4、AIM2炎症小体激活,并观察对易感成分诱导炎症小体活化的影响。采用WB法分别检测细胞上清caspase-1 p20蛋白表达变化,以ELISA检测法测定细胞上清IL-1β、TNF-α含量变化。4.在易感成分激活炎症小体的基础上,检测易感成分对炎症小体激活相关上游靶标的影响,明确其激活炎症小体的机制。采用WB技术分析易感成分对炎症小体激活相关的ASC寡聚化的影响;以流式细胞术测定易感成分对线粒体膜电位及ROS产生的影响;利用免疫荧光检测法观察易感成分对线粒体形态及细胞内炎症小体组装相关蛋白结合的影响。5.以系统辨靶论治为指导思想,提出基于效应靶标互作的补骨脂肝毒性防控策略。将甘草中抑制炎症小体活化的成分甘草多糖、刺甘草查尔酮分别与补骨脂中激活炎症小体的成分进行组分配伍,采用WB法检测组分配伍前后caspase-1p20蛋白及ASC寡聚变化、以ELISA法测定配伍前后IL-1β、TNF-α的含量变化。研究结果:1.本课题在前期建立的体外肝损伤药物筛选评价体系基础上,研究了补骨脂中多种活性成分对炎症小体的调节作用。结果表明补骨脂中单萜酚类成分补骨脂酚(Bakuchiol,Bak)、香豆素类成分补骨脂定(psoralidin)均可诱导caspase-1p20蛋白表达、显著增加细胞上清IL-1β和TNF-α的含量,表明两者均可激活炎症小体,且补骨脂酚激活效应更强,提示Bak可能是补骨脂特异质肝损伤的主要易感成分。2.基于LPS诱导的免疫应激小鼠模型,研究Bak致特异质肝损伤的作用。结果表明,Bak(15、30 mg/kg)在正常小鼠中不会诱导血清中ALT、AST、IL-1β、TNF-α含量增加,也不会增加肝脏中IL-1β、IL-18和TNF-α表达水平,且肝脏组织无炎性浸润、肝细胞完整,表明该给药剂量不会造成肝脏损伤;Bak(15、30mg/kg)在LPS诱导的免疫应激模型中可显著增加小鼠血清中ALT、AST、IL-1β、TNF-α和肝脏中IL-1β、IL-18、TNF-α表达,剂量依赖地增加肝脏caspase-1 p20蛋白表达,还可加重肝脏组织炎性浸润、肝细胞损伤等病理变化,表明Bak主要通过激活炎症小体从而导致免疫特异质肝损伤。3.基于LPS诱导的体外炎症小体激活模型,使用多种抑制剂(MCC950、echinatin、ODN)、Nlrp3基因敲除及靶向沉默Aim2基因表达,研究Bak诱导炎症小体激活的特异性。结果表明,MCC950、echinatin、敲除Nlrp3基因均不影响Bak诱导的caspase-1 p20蛋白表达及IL-1β、TNF-α的释放;AIM2抑制剂及干扰Aim2基因表达均可以显著抑制Bak诱导的炎症小体激活,表明Bak主要通过激活AIM2炎症小体诱导机体过度炎症反应从而导致特异质肝损伤。4.在Bak激活炎症小体的基础上,对AIM2炎症小体组装激活相关的调控靶标进行了研究。结果表明,Bak可诱导AIM2炎症小体激活相关的ASC寡聚化;通过对细胞线粒体的形态、膜电位、ROS进行观察和测定,发现Bak可损伤线粒体形态、降低线粒体膜电位、增加线粒体ROS的产生,推测Bak可能是通过诱导线粒体损伤使得线粒体DNA异常释放至胞质中而被AIM2感受器识别,激活AIM2炎症小体。进一步,通过免疫荧光法观察到Bak可促进胞质中DNA与AIM2聚合,表明NirogacestatBak主要是通过诱导线粒体损伤释放线粒体DNA从而激活AIM2炎症小体。5.分别Biomolecules将甘草多糖、刺甘草查尔酮与Bak、补骨脂定联合使用,发现组分配伍后可显著抑制Bak、补骨脂定诱导的caspase-1蛋白表达、ASC寡聚化以及炎症因子IL-1β、TNF-α的产生。以上结果表明,甘草中的组分如甘草多糖、刺甘草查尔酮可分别抑制Bak、补骨脂定诱导的炎症小体激活,起到基于效应靶标调控的配伍减毒作用。研究结论:本课题对补骨脂特异质肝损伤的易感成分及潜在机制进行了研究。采用体外免疫活化模型,筛选并发现了补骨脂中激活炎症小体的主要化学成分为Bak,并联合体内免疫应激模型明确了Bak是补骨脂特异质肝损伤的主要易感成分;系统地阐释了Bak激活AIM2炎症小体的作用特点及靶标机制;初步明确补骨脂-甘草组配伍可抑制补骨脂中多成分诱导的过度炎症反应。该课题揭示了补骨脂诱导特异质肝损伤的易感物质及可能的分子机制,提出了基于效应靶标互作的补骨脂肝毒性风险防控策略,为补骨脂临床安全用药提供了参考依据。

点柄粘盖牛肝菌(Suillus granulatus)是一种珍贵的野生食用菌,因其风味独特、营养丰富,而广受消费者喜爱。由于鲜品不易贮存,干制成为其生产中的主要加工方式。干制后的点柄粘盖牛肝菌具有更加浓郁的风味,但随着储藏时间的延长,其风味和营养品质大大降低。目前关于提升食用菌干制品风味的研究鲜有报道,因此探索可提高干制食用菌风味品质的处理技术具有重要意义。光照和氧气是影响食品风味和营养品质且易于调节的主要外界条件。光是一种复合光,具有能量,包括不同能量的单色光selleckchem Gefitinib-based PROTAC 3,可通过诱导某些光化学反应而影响食用菌品质。由于干制品大量失水,氧气对其影响或许远小于光照。包装是实现对光氧环境控制的一种最安全、方便、经济的方式。本研究以在60℃下干制的点GW4869细胞培养柄粘盖牛肝菌为研究对象,首先通过透光真空包装、避光真空包装、透光非真空包装、避光非真空包装四种包装方式比较了光和氧对干制点柄粘盖牛肝菌在储藏过程中风味品质的影响,明确光可提高其风味品质。为从光的组成上揭示其影响机制及推进该技术在食用菌加工产业中的应用,进而深入探究了不同能量的单色光对干制点柄粘盖牛肝菌风味、营养、复水性、质地和微观结构的影响,主要研究结果如下:(1)透光包装下鲜味氨基酸含量、等效鲜味浓度、电子舌鲜味评分和香气综合评分在储藏4-6个月时相对较高。苯乙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和香叶基丙酮均在透光包装中含量较高,平均气味活性值分别为27、218和174,是干制点柄粘盖牛肝菌的关键香气成分。氧对干制点柄粘盖牛肝菌的风味无显著影响。因此,光可提高干制点柄粘盖牛肝菌的风味。(2)蓝光处理的干制点柄粘盖牛肝菌的鲜味氨基酸含量、5′-核苷酸含量、EUC值和电子舌鲜味得分、香气品质的综合得分均较高。五种光处理下的鲜味和香气均在光照6天和9天时较好。偏最小二乘判别分析表明不同光处理之间苯甲醛、甜味、芳樟醇、4-苯基吡啶、香叶基丙酮、天冬氨酸、谷氨酸、2,5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪、1-辛烯-3-醇、5-庚烯-2-醇、苯乙醇和甲基庚烯酮的差异是导致风味差异的主要原因。(3)蓝光处理的干制点柄粘盖牛肝菌中可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、黄酮含量、多酚含量和复水比均相对较高且在光照6天Medical care时最高,复水后的硬度和弹性等质构值相对较低。蓝光处理下的孔隙结构更为清晰,孢子损伤程度最大,这从微观结构角度揭示了蓝光处理下干制点柄粘盖牛肝菌的复水性、质地和营养品质相对较好的原因。综上,光可提高干制点柄粘盖牛肝菌的风味品质,蓝光下不仅具有最佳的风味,也具有较好的营养及复水特性。因此,蓝光可作为提高干制食用菌品质的一种简单高效的处理技术。本研究在干制食用菌品质改善上具有一定的理论意义和良好的应用前景。

点柄粘盖牛肝菌(Suillus granulatus)是一种珍贵的野生食用菌,因其风味独特、营养丰富,而广受消费者喜爱。由于鲜品不易贮存,干制成为其生产中的主要加工方式。干制后的点柄粘盖牛肝菌具有更加浓郁的风味,但随着储藏时间的延长,其风味和营养品质大大降低。目前关于提升食用菌干制品风味的研究鲜有报道,因此探索可提高干制食用菌风味品质的处理技术具有重要意义。光照和氧气是影响食品风味和营养品质且易于调节的主要外界条件。光是一种复合光,具有能量,包括不同能量的单色光selleckchem Gefitinib-based PROTAC 3,可通过诱导某些光化学反应而影响食用菌品质。由于干制品大量失水,氧气对其影响或许远小于光照。包装是实现对光氧环境控制的一种最安全、方便、经济的方式。本研究以在60℃下干制的点GW4869细胞培养柄粘盖牛肝菌为研究对象,首先通过透光真空包装、避光真空包装、透光非真空包装、避光非真空包装四种包装方式比较了光和氧对干制点柄粘盖牛肝菌在储藏过程中风味品质的影响,明确光可提高其风味品质。为从光的组成上揭示其影响机制及推进该技术在食用菌加工产业中的应用,进而深入探究了不同能量的单色光对干制点柄粘盖牛肝菌风味、营养、复水性、质地和微观结构的影响,主要研究结果如下:(1)透光包装下鲜味氨基酸含量、等效鲜味浓度、电子舌鲜味评分和香气综合评分在储藏4-6个月时相对较高。苯乙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和香叶基丙酮均在透光包装中含量较高,平均气味活性值分别为27、218和174,是干制点柄粘盖牛肝菌的关键香气成分。氧对干制点柄粘盖牛肝菌的风味无显著影响。因此,光可提高干制点柄粘盖牛肝菌的风味。(2)蓝光处理的干制点柄粘盖牛肝菌的鲜味氨基酸含量、5′-核苷酸含量、EUC值和电子舌鲜味得分、香气品质的综合得分均较高。五种光处理下的鲜味和香气均在光照6天和9天时较好。偏最小二乘判别分析表明不同光处理之间苯甲醛、甜味、芳樟醇、4-苯基吡啶、香叶基丙酮、天冬氨酸、谷氨酸、2,5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪、1-辛烯-3-醇、5-庚烯-2-醇、苯乙醇和甲基庚烯酮的差异是导致风味差异的主要原因。(3)蓝光处理的干制点柄粘盖牛肝菌中可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、黄酮含量、多酚含量和复水比均相对较高且在光照6天Medical care时最高,复水后的硬度和弹性等质构值相对较低。蓝光处理下的孔隙结构更为清晰,孢子损伤程度最大,这从微观结构角度揭示了蓝光处理下干制点柄粘盖牛肝菌的复水性、质地和营养品质相对较好的原因。综上,光可提高干制点柄粘盖牛肝菌的风味品质,蓝光下不仅具有最佳的风味,也具有较好的营养及复水特性。因此,蓝光可作为提高干制食用菌品质的一种简单高效的处理技术。本研究在干制食用菌品质改善上具有一定的理论意义和良好的应用前景。

目的:对于由肿瘤、外伤以及炎症等原因导致的骨缺损,机体的自我修复能力受限,而目前尚无理想的骨替代材料能够促进缺损的骨组织再生。本研究采用挤压式三维(Three-dimension,3D)打印技术制备负载阿仑膦酸钠(Alendronate,ALN)的多孔纳米羟基磷灰石(Nano-hydroxyapatite,nHA)/海藻酸钠(Sodium alginate,SA)/聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)复合支架,以模仿骨组织的构造和力学性能IgE-mediated allergic inflammation;采用各种表征手段探究该支架的材料属性、药物缓释能力以及体外生物学行为,以初步探索其作为人工植入物的应用前景。方法:(1)将不同含量的nHA(分别为50wt%、60wt%、70wt%)与SA共混获得均匀的打印墨水,通过测试各组墨水的流变性来评估其打印的可行性;(2)采用挤压式3D打印机按照预定的设计进行支架的打印,并分别命名为nHA50、nHA60和nHA70支架。随后采用浸渍法将PCL组装到复合支架表面,得到的支架分别命名为nHA50P、nHA60P和nHA70P支架;(3)采用扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)、傅里叶变换红外光谱仪(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)对支架的形貌、结构及组分进行表征,并进行孔隙率检测;(4)检测所有支架的机械性能、亲水性能和溶胀性能,以评估是否达到组织工程支架的应用要求;(5)将ALN载入性能更为优异的nHA60P支架和作为对照组的nHA60支架中,获得nHA60P-ALN和nHA60-ALN支架并进行FTIR检测。同时在14天中定期收集支架的浸提液进行吸光度(Optical density,OD)的检测,分析PCL涂层对支架中ALN的控缓释作用;(6)采用CCK-8法对nHA60、nHA60P和nHA60PALN支架的细胞毒性及促增值能力进行检测。结果:(1)不同nHA含量的打印墨水均具有剪切变稀的能力,且支撑性良好,符合挤压式3D打印的要求;(2)nHA50、nHA60和nHA70支架均按照预定的形状打印成型,nHA50P、nHA60P和nHA70P支架的涂层均匀涂覆于表面,所有支架的孔隙规则且相互连通,具有良好的成形性;(3)SEM结果显示,所有支架表面呈现凹凸不平的粗糙表面,内部则为疏松的多孔结构,有利于细胞的生长活动。FTIR和XRD结果显示,复合支架中存在nHA、SA和PCL成分且性质没有发生明显的改变。六组支架的孔隙率在86-91%之间,提供了较大的表面积便于细胞的粘附生长;(4)力学实验显示,随着nHA比例的提高,nHA50、nHA60和nHA70无涂层支架与nHA50P、nHA60P和nHA70P涂层支架的压缩强度和模量均呈STM2457纯度现先增加后减少的趋势,且PCL涂层支架均高于无涂层支架,因此nHA60P支架的压缩强度最高,达到了16 MPa。亲水性实验显示,PLX-4720说明书nHA50、nHA60和nHA70支架的接触角依次降低(P<0.05),而nHA50P、nHA60P和nHA70P支架的接触角因其表面涂覆PCL有所增加,但均小于90°,依然可定义为亲水性材料。溶胀实验表明所有复合支架均在12 h后达到溶胀平衡,其中以nHA60P支架的溶胀率最低,这有助于支架在植入体内后保持良好的结构稳定性;(5)对nHA60-ALN和nHA60P-ALN进行FTIR检测,显示ALN被成功的载入且其性质未发生明显改变。药物缓释实验表明,与nHA60-ALN支架相比,nHA60P-ALN支架的药物释放曲线更为平缓,因此PCL涂层可以延长ALN的释放时间,起到很好的控缓释作用;(6)细胞毒性实验显示成骨细胞在nHA60、nHA60P和nHA60P-ALN支架浸提液中的生存率均高于80%,且在支架中载入0.5wt%的ALN并不会影响成骨细胞的活动。随后将各组支架与成骨细胞共培养,各组支架材料均可以促进成骨细胞的增殖,且以nHA60P-ALN支架的促增殖效果最佳。结论:将nHA与SA结合,再辅以性能优良的PCL和促进成骨细胞增殖的ALN,最终制备出来的载药复合支架具有疏松多孔的微观结构、优良的力学性能、较好的亲水性、适宜的溶胀性、良好的药物缓释作用和生物相容性等特性,为临床修复骨缺损提供了一种新的候选材料,并为ALN在组织工程的应用打下了坚实的基础。

目的:非小细胞肺癌发病率高,5年生存率低。肺癌的早期诊断和治疗决定其预后。有研究显示,与p元素诱导的睾丸萎缩(P-element Induced Wimpy Testis,PIWI)蛋白相互作用的核糖核酸(PIWI-interacting RNA,piRNA)对肿瘤发生发展起着重要的调控作用。本研究首先在人血清外泌体中筛选出差异表达的piR-hsa-164586,并进一步探究其对人非小细胞肺癌的诊断价值及相应的调控机制。方法:高通量测序筛选人非小细胞肺癌组织和癌旁组织中差异性表达的piRNAs;实时定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR)检测非小细胞肺癌患者与健康人血清外泌体、非小细胞肺癌细胞与肺正常上皮细胞中piR-hsa-164586的差异性表达,并通过q RT-PCR检测血清外泌体中的piR-hsa-164586在室温环境中的稳定性;低浓度脱氧核糖核苷三磷酸反转录-PCR扩增实验(Reverse Transcription at Low dNTP concentrations followed PCR,RTL-P)检测piR-hsa-164586 3’端存在甲基化的特征;荧光原位杂交(FluorescRAD001采购ence in-situ hybridization,FISH)实验观察piR-hsa-164586的细胞定位;受试者操作特性(receiver operating characteristic,ROC)曲线比较piR-hsa-164586与细胞角蛋白19片段(Cytokeratin-19-fragment,CYFRA21-1)对人早期非小细胞肺癌的诊断效能。分别将piR-hsa-164586过表达和敲低,通过在A549和HCC2279细胞及裸鼠体内验证piR-hsa-164586在非小细胞肺癌中发挥的调控作用;核醣核酸交互作用沉降(RNA pull down)实验获得与piR-hsa-164586结合的蛋白,进行蛋白质谱分析后进一步通过RNA pull down实验和核醣核酸结合蛋白免疫共沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)实验,验证piR-hsa-164586与靶标蛋白的结合关系;最后通过q RT-PCR、蛋白免疫印迹和组织免疫荧光染色实验从m RNA水平和蛋白水平验证piR-hsa-164586对下游靶标蛋白的调控作用。结果:(1)piR-hsa-164586在非小细胞肺癌患者的血清外泌体和肺腺癌细胞A549、肺鳞癌细胞HCC2279中的表达水平显著高于健康人和人正常肺上皮细胞BEAS-2B(P<0.05),且在核糖核酸酶A非处理组和处理组中无明显统计学差异(P=0.1418),在室温下放置12、24、48小时不同时间段也无明显统计学差异(P=0.3625);RTL-P实验发现piR-hsa-164586在低浓度脱氧核糖核苷三磷酸下无法完成反转录;FISH实验发现,用吲哚三碳菁标记的piR-hsa-164586主要在A549和HCC2279胞核内检测到;(2)ROC曲线结果表明,piR-hsa-164586对人早期非小细胞肺癌的诊断效能高于临床常用的CYFRA21-1,其曲线下面积为0.623(95%置信区间:0.527-0.720),敏感度为0.535,特异性为0.587;(3)Ed U细胞增殖实验结果表明,在A549细胞中将piR-hsa-164586过表达,细胞增殖活力为49.06%±6.5%,显著高于对照组31.20%±3.19%(P<0.05);在HCC2279细胞中将piR-hsa-164586过表达,细胞增殖活力为60.16%±6.40%,也显著高于对照组35.90%±2.85%(P<0.05);CCK-8细胞增殖实验结果显示,在24、48、72、96h,piR-hsa-164586过表达后A549和HCC2279细胞增殖活力显著增强(P<0.05);流式细胞术结果表明,在A549细胞中将piR-hsa-164586过表达,细胞凋亡率为6.97%±0.96%,显著低于对照组12.06%±1.41%(P<0.05);在HCC2279细胞中细胞凋亡率为13.77%±0.82%,也显著低于对照组15.66%±0.50%(P<0.05);划痕实验结果表明,在A549细胞中将piR-hsa-164586过表达,细胞迁移率为44.27%±3.07%,显著高于对照组26.02%±5.55%;在HCC2279细胞中细胞迁移率为50.40%±2.66%,也显著高于对照组33.52%±1.93%(P<0.05)。细胞迁移(Transwell)实验结果表明,在A549细胞中将piR-hsa-164586过表达,细胞迁移数目是6347±967个,显著多于对照组3331±644个(P<0.05Berzosertib生产商);HCC2279细胞细胞迁移数目是349±57个,显著高于对照组211±35个(P<0.05)。在A549和HCC2279细胞中敲低piR-hsa-164586,上述功能实验则产生了相反的结果(P<0.05)。(4)裸鼠皮下成瘤实验发现,过表达piR-hsa-164586后肿瘤的体积显著增大,重量显著升高;ki67荧光信号为66.80%±8.25%,显著高于对照组20.35%±1.72%(P<0.05);α-SMA阳性率为59.76%±1.99%,显著高于对照组43.97%±5.40%(P<0.05);CD31的阳性个数为44.67±3.68,显著多于对照组34.00±2.45(P<0.05),而敲低piR-hsa-164586则产生相反的结果(P<0.05)。(5)Pulldown和RIP实验结果表明,piR-hsa-164586可以与肌球蛋白重链9(myosin heavy polypeptide 9,MYH9)相互结合,且过表达piR-hsa-164586可以从m RNA和蛋白质水平上调MYH9的表达(P<0.05);(6)Transwell实验显示,敲低MYH9会使A549细胞迁移数目减少,过表达piR-hsa-164586会导致细胞迁移数目显著增加。同时将MYH9和piR-hsa-164586敲低,会使细胞迁移数目进一步减少;敲低MYH9,会显著减少过表达piR-hsa-164586引起的细胞迁移数目(P<0.05)。结论:1.在非小细胞肺癌患者的血清外泌体和细胞中,piR-hsa-164586的表达明显高于健康人的血清外泌体和正常肺上皮细胞。2.piR-hsa-164586可在血清外泌体中稳定存在,对早期非小细胞Anti-biotic prophylaxis肺癌的诊断效能优于临床常用的生物标志物CYFRA21-1。3.过表达piR-hsa-164586在体内外会促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和血管生成能力但抑制凋亡,敲低piR-hsa-164586则会产生相反的作用。4.piR-hsa-164586在非小细胞肺癌细胞内主要通过与MYH9相互作用,促进癌细胞的迁移。

目的 探讨大车前苷在小鼠脓毒症心肌损伤中的作用。方法 选取8～10周龄的雄性C57/BL6小鼠40只，根据处理方式不同将小鼠随机分为4组：生理盐水+生理盐水组、生理盐水+大车前苷组、脂多糖+生理盐水组、脂多糖+大车前苷组，每组10只。脂多糖+生理盐水组与脂多糖+大车前苷组小鼠接受单次腹腔注射脂多糖(10 mg/kg),以构建小鼠脓毒症模型；生理盐水+生理盐水组与生理盐水+大车前苷组小鼠接受同等体积生理盐水腹腔注射。生理盐水+大车前苷组与脂多糖+大车前苷组小鼠给予连续5 d的大车前苷50 mg/(kg·d)灌胃干预，生理盐水+生理盐水组与脂多糖+生理盐水组进行同等体积生理盐水灌胃。实验第1天，先给予小鼠连续5 d大车前苷确认细节50 mg/(kg·d)或生理盐水灌胃，第5天给予小鼠单次腹腔注射脂多糖(10 mg/kg)或者等体积生理盐水，饲养12 h后检测心功能并取材。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测超氧化物歧化酶2 (SOD-breast pathology2)、谷胱甘肽过氧化物酶-1 (GPX-1)和过氧化氢酶(CAT)和相关炎症因子[白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6 (IL-6)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)和白细胞介素-4 (IL-4)]的mRNA水平。用检测试剂盒检测丙二醛(MDA)、4-羟基壬烯醛(4-HNE)、GPX-1、TNF-α和MCP-1以及Caspase-3的水平；检测血液中心肌肌钙蛋白I(cTnI)、乳酸脱氢酶(LDH)水平；用TUNEL染色检测心肌细胞凋亡水平。结果 与生理盐水+生理盐水组小鼠相比，脂多糖+生理盐水组小鼠的心率、左室射血分数以及左室短轴缩短率降低，心肌损伤标志物cTnI、LDH水平升高，差异有统计学意义(P<0.05);大车前苷可恢复小鼠的心率、左室射血分数、左室短轴缩短率，以及降低心肌损伤标志物cTnI和LDH的水平，提高小鼠生存率(P<0.05)BAY 73-4506。与脂多糖+生理盐水组小鼠相比，脂多糖+大车前苷组小鼠心脏中MDA、4-HNE的水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。大车前苷可降低小鼠心脏中炎症因子表达、Caspase-3的活性、细胞凋亡水平(P<0.05)。结论 大车前苷可以减轻脂多糖诱导的小鼠心肌细胞损伤，改善其心功能。

目的 研究吲哚丙酸（IPA）对溃疡性结肠炎（UC）小鼠肠道巨噬细胞和肠道菌群的调节作用。方法 将SPF级6～8周龄雄性C57BL/6小鼠按随机数表法分为对照组、葡聚糖硫酸钠组（DSS模型组，饮用3%DSS7 d）及IPA组（在DSS给药前2 d行IPA灌胃），每组12只。每日观察小鼠体质量变化；DSS给Critical Care Medicine药第7天处死小鼠，测量结肠长度及评定病理学评分，采用流式细胞术检测肠道巨噬细胞M1/M2比例，并用16S r RNA基因测序技术检测肠道菌群的变化。结果 与对照组比较，DSS模型组小鼠体质量显著下降，结肠组织病理学评分、肠道巨噬细胞M1/MAlisertib供应商2比值显著升高，结肠长度显著缩短（均P<0.05）；与DSS模型组比较，IPA组小鼠体质量下降程度降低，结肠长度增BMN 673纯度加，结肠组织病理学评分、肠道巨噬细胞M1/M2比值均降低（均P<0.05）；增加了肠道菌群丰度及多样性，显著增加了普雷沃菌属丰度，减少了拟杆菌属和肠球菌属的丰度。结论 IPA可以通过调节肠道巨噬细胞M1/M2的比例和增加肠道菌群多样性缓解UC小鼠的症状。

【目的】:观察美洲大蠊研粉干预的脊髓半横断损伤(h SCI)大鼠后肢运动功能恢复情况;探讨美洲大蠊研粉对h SCI大鼠后肢运动功能和损伤区域自噬流以及氧化应激的影响。【方法】:1、实验分组:(1)第一部分:50只雌性SD大鼠随机数表法分为5组:分别为假手术(Sham)组、生理盐水(SCI+NS)组、美洲大蠊研粉210mg/kg(SCI+210mg/kg)组、美洲大蠊研粉420mg/kg(SCI+420mg/kg)组、美洲大蠊研粉630mg/kg(SCI+630mg/kg)组;Sham组仅打开椎板,不做任何处理,其他组别均行左侧脊髓半横断损伤。术前30min和术后每天均行灌胃处理,每只大鼠每次灌胃量均为5ml。Sham组和SCI+NS组为NS,其他组为5ml不同剂量的美洲大蠊研粉溶液,术后14d处死取材。(2)第二部分:60只雌性SD大鼠随机数表法分为生理盐水(SCI+NS)组和美洲大蠊研粉630mgVX-661 IC50/kg(SCI+630mg/kg)组,均行脊髓左侧半横断损伤,各30只。每组分为5个时间点,分别是术后6h、第1d、3d、7d、14d,每个时间点各6只。术前30min SCI+NS组予以5ml/只的NS灌胃、SCI+630mg/kg组以630mg/kg美洲大蠊研粉溶液5ml/只灌胃,根据时间点处死取材。2、观察指标:(1)观察第一部分大鼠各组术前、术后6h、第1d、3d、7d、14d的BBB评分和术后第14d的足迹印迹情况。(2)苏木精-伊红染色(HE染色):观察第一部分大鼠各组术后第14d h SCI区域的病理学变化。(3)尼氏染色:观察第一部分大鼠各组术后第14d h SCI区域的神经元数目。(4)ELISA实验:检测第一部分大鼠术后第14d h SCI区域MDA、8-OHdG的含量;检测第二部分大鼠术后6h、第1d、3d、7d、14d h SCI区域MDA、8-OHd G的含量。(5)Western blot实验:检测第一部分大鼠术后第14d h SCI区域的Beclin-1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、p62表达情况;检测第二部分大鼠术后6h、第1d、3d、7d、14d h SCI区域Beclin-1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、p62表达情况。【结果】:1、美洲大蠊研粉治疗14d后,与Sham组比较,其他组从术后6h起,BBB评分均低于Sham组,差异有统计学意义(P<0.05);与SCI+NS组比较,SCI+210mg/kg组、SCI+420mg/kg组、SCI+630mg/kg组BBB评分在术后第7d、第14d均高于SCI+NS组,差异有统计学意义(P<0.05);SCI+210mg/kg组、SCI+420mg/kg组、SCI+630mg/kg组两两相互比较术后第14d BBB评分均有差异(P<0.05),其中SCI+630mg/kg组最高。足迹结果显示经过美洲大蠊研粉治疗后第14d,大鼠h SCI后的足迹无拖拽痕迹,足迹清晰,美洲大蠊研粉各剂量组足迹分辨情况均优于SCI+NS组。2、HE染色:SCI+NS组组织结构疏松,灰质部分明显损伤,神经元出现明显的水肿、核碎裂、核溶解等病理变化,整个视野未见正常形态的神经元,美洲大蠊研粉各剂量组神经元仍然出现水肿、核碎裂等病理变化,但神经元形态相对完整,其水肿程度、核碎裂、核溶解等病理变化较SCI+NS组轻。美洲大蠊研粉各剂量治疗均能减轻神经元的损伤程度,其中以剂量为630mg/kg的组别大鼠的神经元损伤最轻。3、尼氏染色:Sham组神经元数目最多,其次是SCI+630mg/kg组、SCI+420mg/kg组、SCI+210mg/kg组,SCI+NS组的神经元数目最少。4、MDA、8-OHdG的含量:第一部分各组大鼠与SCI+NS组比较,术后第14d Sham组、SCI+210mg/kg组、SCI+420mg/kg组、SCI+630mg/kg组MDA、8-OHd G含量均低于SCI+NS组,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分SCI+NS组与SCI+630mg/kg组大鼠各时间点相互比较,术后第7d、第14d SCI+630mg/kg组MDA、8-OHd G含量低于SCI+NS组Fulvestrant,差异有统计学意义(P<0.05),两组分别进行组内各时间点比较,SCI+NS组MDA、8-OHd G术后6h时开始升高,术后第7d达高峰,然后开Integrative Aspects of Cell Biology始下降;SCI+630mg/kg组MDA、8-OHd G术后6h时开始升高,术后第3d达高峰,然后开始下降。5、Beclin-1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、p62表达:第一部分各组大鼠与SCI+NS组比较,术后第14d Sham组、SCI+210mg/kg组、SCI+420mg/kg组、SCI+630mg/kg组Beclin-1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表达均高于SCI+NS组,差异有统计学意义(P<0.05),SCI+210mg/kg组、SCI+420mg/kg组、SCI+630mg/kg组p62表达均低于SCI+NS组,Sham组p62高于SCI+NS组,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分大鼠SCI+NS组与SCI+630mg/kg组各时间点比较,SCI+630mg/kg组Beclin-1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表达在术后第7d、第14d均高于SCI+NS组,p62在术后6h、第1d、3d、7d、14d均低于SCI+NS组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组分别进行组内比较,SCI+NS组Beclin-1表达从术后6h开始升高,第1d达到高峰随后开始下降,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表达从术后6h开始升高,第3d达到高峰随后开始下降,p62的表达从术后6h开始下降,第3d时达到低峰,随后开始升高。SCI+630mg/kg组Beclin-1和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表达趋势一致,表达都从术后6h开始升高,第3d达到高峰随后开始下降,p62表达都从术后6h开始下降,第3d达到低峰,随后开始上升。【结论】:1、美洲大蠊研粉能促进h SCI大鼠后肢运动功能的恢复,且呈剂量依赖,以630mg/kg效果最佳。2、美洲大蠊研粉减少了大鼠h SCI区域MDA、8-OHd G的含量,抑制了氧化应激反应。3、美洲大蠊研粉上调了大鼠h SCI区域自噬蛋白Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ,下调p62的表达,促进自噬流,增强自噬。

微生物底盘细胞是构建性能优良细胞工厂、实现生物制造产业化的核心。运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是非模式天然乙醇生产菌株,因其独特的生理与遗传特性而成为纤维素乙醇及其他生物基平台化合物生产的优良底盘细胞。然而,在纤维素乙醇及其他平台Gefitinib-based PROTAC 3使用方法化合物生产中,在原材料预处理和酶解时会产生抑制物,从而影响发酵过程中Z.mobilis的生长速率和发酵性能,因此其抗逆性与鲁棒性的优化对高效细胞工厂的开发意义重大。前期研究表明过表达全局性调控因子hfq有助于Z.mobilis耐受多种水解抑制物及产物乙醇,但过表达hfq增强乙醇耐受的分子机制尚未阐明。此外,尽管Z.mobilis已经建立了基于内源和外源CRISPR-Cas系统的基因编辑工具,但基因组编辑工具少及编辑效率低等问题制约了底盘细胞重编程优化及应用。本研究以Z.mobilis ZM4为模式,利用系统生物学方法对hfq过表达增强乙醇耐受的分子机制进oil biodegradation行了探究。首先构建了hfq过表达(ZM4-hfq)以及hfq敲除(ZM4-(35)hfq)重组菌株。在8%乙醇胁迫下,hfq过表达有效改善了ZM4的细胞生长,加速了葡萄糖消耗和乙醇生产;而ZM4-(35)hfq的乙醇耐受性则被明显抑制。ZM4和hfq重组菌株的转录组学研究结果表明乙醇胁迫导致了许多基因的差异表达,主要与细胞壁/膜生成、代谢、转录和一般应激反应有关。乙醇胁迫条件下hfq过表达鞭毛相关基因的下调可能为细胞生长保存能量。生化和遗传分析结果显示,hfq过表达参与了硫酸盐同化和半胱氨酸生物合成路径的正向调控,有助于消除乙醇抑制诱导产生的ROS(reactivselleck激酶抑制剂e oxygen species,ROS)。本研究也建立了一种新的蛋白互作分析方法——酵母内质网分离筛选(Yeast Endoplasmic Reticulum Sequestration Screening,YESS)系统,并将其应用于Hfq蛋白互作研究。YESS结果表明Hfq可能通过与Dna K/J的相互作用间接影响Rpo H活性,进而对Rpo H介导的细胞质应激反应进行调节。进一步将YESS系统与免疫共沉淀-质谱联用(Co-Immunoprecipitation-mass spectrometry,Co-IP-MS)方法结合,发现ZMO1690、ZMO0989等蛋白可能通过与Hfq结合增强Z.mobilis的乙醇耐受性。为解决Z.mobilis基因组编辑工具少的问题,本研究尝试了将Argonaute可编程核酸酶应用于Z.mobilis基因组编辑。首先,对来源于硫代热球菌(Thermococcus thioreducen)的Argonaute核酸酶(Ttd Ago)进行了体外表征。结果表明,Ttd Ago具备核酸内切酶的活性,对DNA靶标有着强烈偏好,可利用guide DNA在高温下切割ss DNA和ds DNA质粒,且其切割的效率和精确性受温度、二价金属离子、guide的磷酸化和长度及其与DNA靶标间互补性的影响。Ttd Ago发挥活性需要二价金属离子如Mn~(2+)、Mg~(2+)。Ttd Ago在30～95 ~oC的宽温度范围内可切割ss DNA,且在70～80 ~oC时活性较好。Ttd Ago至少需要16 nt guide DNA才可发进行切割,优先使用5’末端磷酸化的guide DNA,且对guide的5’末端核苷酸没有明显偏好;Ttd Ago对guide与靶标之间的碱基错配有相对较高的容忍度。Ttd Ago可利用单个或一对guide DNA来产生ds DNA断裂。此外,在Ttd Ago的体内表征中,本研究发现了Ttd Ago对Z.mobilis细胞具有毒性,导致生长速率和最终生物量降低,而hfq的过表达可以帮助缓解Ttd Ago的细胞毒性。初步研究也表明Ttd Ago在Z.mobilis中可能有编辑活性。综上所述,本研究系统研究了hfq过表达增强Z.mobilis乙醇耐受的分子机制,鉴定了与乙醇胁迫耐受相关的基因,为Z.mobilis乙醇耐受提供了遗传改造靶点。本研究也对可编程Ago核酸酶Ttd Ago进行了催化机理探究,拓宽了对原核Ago蛋白的认识;并初步鉴定了Ttd Ago在Z.mobilis的体内编辑活性,为开发基于Ago核酸酶的工业微生物基因组编辑工具奠定了基础。同时,本研究在Z.mobilis中建立的新型蛋白互作研究技术YESS系统也为研究原核微生物蛋白相互作用提供了一种新策略。

目的:探讨经皮颅-耳电刺激(Transcutaneous electrical cranial-auricular acupoint stimulation,TECAS)治疗轻-中度抑郁症(mild-to-moderate major depressive disorder,MDD)患者的临床疗效及其静息态f MRI脑效应机制,并与常用抑郁症药物艾司西酞普兰(escitalopram)临床疗效及脑机制进行比较。方法:2019年11月-2022年1月在西南医科大学附属中医医院收集轻-中度MDD患者及一般资料相匹配的健康志愿者(Healthy controls,HCs)。按照实验要求,总共有50名患者(其中TECAS组及escitalopram组分别为29例和21例)及49例HCs纳入本研究。MDD患者治疗前和治疗后各接受一次静息态f MRI扫描及蒙哥马利抑郁量表(Montgomery–asberg depression rating scale,MADRS)、汉密尔顿抑郁量表(Hamilton depression rating scale,HAMD)及汉密尔顿焦虑量表(Hamilton anxiety rating scale,HAMA)评估,抑郁副作用评定量表(Side effects rating scale,SERS)记录不良反应情况;HCs不做任何干预,仅接受一次静息态f MRI扫描及临床量表评估。第一部分研究:TECAS与escitalopram的抗抑郁疗效比较。(1)对比基线MDD患者和HCs基本信息及临床量表评估(包括MADRS、HAMD及HAMA);(2)分析TECAS组与escitalopram组患者基本信息、临床量表基线水平及治疗前后MADRS、HAMD及HAMA量表评分变化;(3)比较治疗过程中两种方式SERS量表的差异。第二部分研究:基于独立成分分析探究TECAS抗抑郁脑效应机制。(1)基于独立成分分析(Independent component analysis,ICA)分析静息态f MRI数据;(2)分析MDD患者基线水平与HCs间脑功能网络内及网络间功能连接的差异;(3)分别比较TECAS组及escitalopram组患者治疗前后脑功能网络内及网络间功能连Tofacitinib配制接的差异,进而寻找两者脑效应机制的异同;(4)分析TECAS组或escitalopram组患者治疗前后脑功能网络改变与相应临床量表评分间的相关关系。f MRI预处理、功能网络筛选及统计分析均由MATLAB平台的SPM12.0、restplus及GIFT软件完成。结果:第一部分研究:(1)受试者入组情况:共49例HCs及50例MDDselleck NMR完成符合要求的f MRI扫描及临床量表评估;其中TECAS组29例,脱落2例,完成2次评估27例;escitalopram组21例,脱落3例,完成2次评估18例。(2)基本信息与基线情况:MDD与HCsmediolateral episiotomy年龄及性别无统计学差异(P>0.05);受教育程度有统计学差异(P<0.05),但补充瑞文智力测试问卷表明组间智力评分(Intelligence quotient,IQ)无统计学差异(P>0.05);TECAS组和escitalopram组在年龄、性别及受教育程度均无统计学差异(P>0.05)。(3)疗效评估:TECAS和escitalopram均能改善患者的抑郁症状,且两者治疗前后MADRS、HAMD和HAMA的减分率无统计学差异;然而基于这些量表得出的反应率有统计学差异(P<0.05)。(4)SERS量表评估:TECAS组和escitalopram组患者治疗过程中均未出现严重不良反应;组间SERS量表评分无统计学差异(P<0.05),TECAS偶见的副作用包括刺激区皮肤轻度异常等。第二部分研究:(1)ICA分析发现:TECAS和escitalopram均影响默认网络(Default mode network,DMN)、右额顶网络(Right frontoparietal network,RFPN)、背侧注意网络(Dorsal attention network,DAN)和初级视觉网络(Primary visual network,PVN)的功能连接。增高的PVN-RFPN功能连接经两者治疗后均有降低。DMN-RFPN和DMN-DAN功能连接在TECAS治疗后增加,而在escitalopram治疗后则降低。此外,腹侧注意力网络和左额顶网络的功能连接改变仅在出现在escitalopram组。(2)相关性分析表明:TECAS组和escitalopram组患者上述脑功能网络改变与相应临床量表评分间并无显著相关性。结论:(1)TECAS可有效缓解抑郁症症状,并与escitalopram的抗抑郁效应相似,TECAS治疗过程中无严重不良反应情况,偶见的副作用包括刺激区皮肤轻度异常等。(2)TECAS和escitalopram诱导的大脑网络功能连接存在差异,如DMN-RFPN和DMN-DAN功能连接在TECAS治疗后增加,而在escitalopram治疗后则降低;但两者治疗后增高的PVN-RFPN间功能连接均有减低,这可能提示存在共有的脑效应机制。(3)通过回顾脑功能网络发现:DMN在TECAS抗抑郁作用中发挥着重要作用;TECAS有助于调节大脑控制系统功能紊乱和改善记忆及情感性症状。(4)未来应进一步开展大样本随机对照研究,以充分评估其临床疗效和相关脑效应机制。