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目的 分析血液病恶性肿瘤患者25羟基维生素D[25(OH)D]水平对替代供体的异基因造血干细胞移植预后的影响以及并发症急性移植物抗宿主病（aGVHD）的影响。方法 回顾性分析2019年1月至2022年5月期间在河北燕达陆道培医院进行血浆25(OH)D浓度检测的212例患者，查阅HSCT的病例资料及其临床特点，通过Kaplan～Meier法绘制生存曲线；采用cox回归分析进行单因素、多因素分析。结果 33例（15.57%）患者的25(OH)D浓度<12 ng/mL,62例（29.25%）患者的25(OH)D浓度12～20 ng/mL,72例（33.96%）患者的25(OH)D浓度20～30 ng/mL,45例（21.23%）患者的25(OH)D浓度≥30 ng/mL。多因素Cox回R428归分析显示25(OH)D2+D3<12 ng/mL(P<0.001)和Ⅳ度aGVHD(P=0.026;0.023)均是无Immune composition白血病生存LFS和总生存OS的独立风险因素，二次移植是LFS的独立风险因素（P=0.017）。25(OH)D2+D3 <12 ng/mL是aGVHD(P=0.008 2)和Ⅱ～Ⅳ度aGVHDIACS-10759临床试验(P<0.001)的独立风险因素，年龄≥36岁是aGVHD的独立风险因素（P=0.026）。结论 维生素D缺乏是影响HSCT结果的一个独立危险因素：不利于患者预后，容易发生并发症aGVHD，故应及时进行治疗干预。

为了研究蛋白质磷酸化修饰对马疱疹病毒1型(EHV-1)gD囊膜蛋白高尔基体驻留的影响，通过蛋白质修饰质谱技术鉴定gD囊膜蛋selleckchem白磷酸化位点，利Chemical and biological properties用Overlap PCR技术构建磷酸化位点突变型真核表达质粒pCAGGS-gD-S391A-myc及pCAGGS-gD-S391D-myc,并转染至Hela细胞，经Western blot检测野生型及突变型gD囊膜蛋白表达情况，利用间接免疫荧光技术鉴定gD囊膜蛋白及其突变体的亚细胞定位。质谱结果显示，EHV-1 gD囊膜蛋白的S391位点发生磷酸化修饰；测序结果表明，成功构建模拟磷酸化突变型质粒pCAGGS-gD-S391D-myc及模拟去磷酸化突变型质粒pCAGGS-gD-S391A-myc;间接免疫荧光结果显示，模拟磷酸化突变体gD-S391D-myc与野生型gD-mycGDC-0973研究购买定位情况类似，都驻留于高尔基体；而模拟去磷酸化突变体gD-S391A-myc可转运至细胞膜。S391位点的磷酸化修饰对gD囊膜蛋白驻留于高尔基体起到重要作用，阻断该位点磷酸化修饰可促进gD囊膜蛋白转运至细胞膜，为进一步研究gD高尔基体驻留机制提供参考。

目的:肾脏纤维化(Renal fibrosis,RF)是几乎所有的慢性肾脏疾病(Chronic kidney disease,CKD)进展中重要的通路,但关于肾纤维化的具体作用机制尚未完全阐述点击此处明晰。本实验采用HE、Masson、TUNEL、Western Blot、ELISA技术研究益肾活血方对单侧输尿管结扎(Unilateral ureteral obstruction,UUO)诱导大鼠肾纤维化模型细胞焦亡的影响,为治疗慢性肾脏病的道路上提供新的视角。方法:实验中选用清洁级雄性SD大鼠50只,随机分为假手术组,模型组,氯沙坦钾组,益肾活血方低剂量组、益肾活血方中剂量组、益肾活血方高剂量组,其中每组各8只。造模后第1天(d1),假手术组、UUO组予以生理盐水灌胃,益肾活血方(低、中、高)剂量组分别予以益肾活血方(9.03、18.06、36.12)g·kg~(-1)·d~(-1)灌胃,氯沙坦钾组予以氯沙坦钾50 mg·kg~(-1)·d~(-1)灌胃,各组予每日灌胃1次。连续灌胃14天后处死取材,观察各组大鼠的一般情况(毛发、饮食、精神及行为状态、手术伤口感染、体重、双侧肾重等情况)变化,HE染色观察肾脏病理结构改变,Masson染色检测肾脏纤维化程度,TUNEL染色观察肾组织肾小管上皮细胞焦亡情况,Western Blot检测NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD焦亡蛋白的表达水平情况,ELISA检测血清IL-1β含量情况。结果:1.大鼠一般情况结果:假手术组大鼠毛发紧密光亮,饮食正常,反应灵敏,活动正常,两肾脏体积大小及外形均正常,体重增长速度快。UUO模型组大鼠均出现食欲下降、精神萎靡,行为暴躁不安、弓背蜷缩、活动减少、毛发失光、体重增长速度慢、肾系数明显增加的改变(P﹤0.05)。益肾活血方与氯沙坦钾干预后均能降低大鼠的饮水量,提高活动度、体重有不明显的增加,肾系数明显减少(P﹤0.05)。2.HE染色结果:假手术组大鼠肾脏组织在显微镜下观察结构正常,无特异性改变,轮廓清晰可见,肾小管排列整齐,管腔无扩大或缩小,间质区域未见及炎症细胞渗出,未见细胞坏死。模型组大鼠肾脏结构不规则,肾小球边界不清,肾小管排列紊乱无序,部分肾小管扩大,肾间质扩宽,与假手术组相比可见大量炎性细胞浸润。氯沙坦钾组大鼠可见间质的炎性细胞浸润程度相比模型组明显减轻,肾小球结构形态有了一定程度的改善。益肾活血方(低、中、高)剂量组大鼠可见间质间的炎症细胞浸润程度、肾间质肿胀情况明显减轻,肾小球形态结构、肾小管萎缩或管腔扩大情况明显改善。3.Masson染色结果:假手术组大鼠可观察到肾脏结构皮质与髓质部分无异常改变,肾小管与肾小球形态结构均正常,肾间质间可见及少量胶原纤维存在。与假手术组相比,模型组大鼠肾脏组织结构发生明显改变,Angiogenic biomarkers肾小管萎缩,肾间质扩宽,出现大量的蓝色胶原纤维聚集,纤维化面积明显增多(P﹤0.05)。与模型组相比,氯沙坦钾组大鼠可见肾小管结构排列整齐度相对明显改善,肾小球结构较为清晰规则,肾组织间质蓝色胶原纤维化面积明显减少(P﹤0.05)。益肾活血方(低、中、高)剂量组大鼠可见肾小球及肾小管形态结构病变情况减轻,肾间质炎症细胞浸润与纤维化面积明显缩小。与氯沙坦钾组相比,益肾活血方(中、高)剂量组胶原纤维化面积变化差异无统计学意义(P﹥0.05);与益肾活血方低剂量组相比,益肾活血方(中、高)剂量组的大鼠纤维化面积变化差异具有统计学意义(P﹤0.05);与益肾活血方中剂量组相比,益肾活血方高剂量组的大鼠纤维化面积显著减少(P﹤0.05)。4.TUNEL染色结果:假手术组大鼠可见肾脏组织细胞核大呈圆形,未见到明显炎症浸润,可见少量阳性细胞;与假手术组相比,模型组肾脏组织细胞阳性率显著升高,可见明显细胞焦亡(P﹤0.05);与模型组相比,氯沙坦钾组、益肾活血方(低、中、高)剂量组炎症浸润明显减少,部分逆转了肾脏组织细胞焦亡的发生(P﹤0.05);与氯沙坦钾组相比,益肾活血方(低、中)剂量组阳性率较高,益肾活血方高剂量组阳性率较低(P﹤0.05);与益肾活血方低剂量相比,益肾活血方(中、高)剂量阳性率均降低(P﹤0.05);与益肾活血方中剂量相比,益肾活血方高剂量抑制细胞焦亡效果更佳(P﹤0.05)。5.Western Blot检测结果:与假手术组相比,模型组NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD蛋白的表达水平明显上调(P﹤0.05);与模型组相比,氯沙坦钾组、益肾活血方(低、中、高)剂量组均可下调NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD蛋白的表达量(P﹤0.05),其中益肾活血方高剂AG-221 IC50量组下调Caspase-1、ASC最显著(P﹤0.05),氯沙坦钾组下调NLRP3、GSDMD最显著(P﹤0.05)。6.ELISA检测结果:与假手术组相比,模型组肾脏组织的血清IL-1β炎症因子表达水平明显上调(P﹤0.05);与模型组相比,氯沙坦钾组、益肾活血方(低、中、高)剂量组均可下调IL-1β炎症因子的表达水平,其中益肾活血方高剂量组的下调作用最为显著(P﹤0.05)。结论:1.单侧输尿管梗阻模型可诱导肾脏组织中焦亡蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD过表达,释放IL-1β炎症因子,严重损伤肾脏。2.益肾活血方能通过抑制NLRP3/Casapse-1/GSDMD通路,减少诱导肾小管上皮细胞焦亡,发挥抗RF的作用。

目的 探讨前列腺增生（BPH）伴尿路感染患者病原菌分布情况和血清降钙素原（PCT）、尿白细胞酯酶（LEU）及红细胞形态变化及意义。方法 选取2021年6月至2022年12月在江西省于都县中医院收治的BPH患者90例作为BPH组，根据尿细菌培养是否伴有尿路感染将其分为感染组（26例）和未感染组（64例）；另同期选取健康体检人员90名作为对照组。分析感染组患者病原菌分布情况。比较各组血清PCT和红细胞形态相关指标[红细胞刚性指数（IR）、红细胞变形指数（DI）]水平，采用受试者工作特征曲线分析上述指确认细节标对BPH伴尿路感染的诊断效能；检测尿LEU，以尿细菌此网站培养的尿路感染为金标准，采用Kappa一致性分析尿LEU对尿路感CBT-p informed skills染的诊断效能。结果 26例尿路感染患者共检出病原菌48株，其中革兰阴性菌占56%(27/48)，以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主，革兰阳性菌占35%(17/48)，以屎肠球菌和表皮葡萄球菌为主，真菌占8%(4/48)，且有11例患者同时合并2种细菌感染。感染组、未感染组患者血清PCT水平分别为（3.95±0.78）ng/ml、（1.34±0.35）ng/ml，高于对照组（0.26±0.06）ng/ml,IR、DI水平分别为（1.90±0.48）、（3.63±0.72）、（0.31±0.08）、（0.47±0.12），均低于对照组（5.29±1.24）、（0.61±0.17）(P<0.05)，且相较于未感染组，感染组患者血清PCT水平更高，IR和DI水平更低（P<0.05）。血清PCT、IR和DI水平诊断BPH伴尿路感染的曲线下面积分别为0.780、0.767和0.781(P均<0.05)。尿LEU阳性（感染）19例，其诊断BPH伴尿路感染的敏感度、特异度、准确率、阳性预测值、阴性预测值和Kappa值分别为73.08%、92.19%、86.67%、79.17%、89.39%和0.668。结论 BPH伴尿路感染患者的主要致病菌为革兰阴性菌，血清PCT水平呈异常升高，IR和DI水平呈异常降低，尿LEU呈阳性，临床可通过检测血清PCT、尿LEU、IR和DI水平来辅助诊断BPH伴尿路感染。

目的:本研究拟明确植物乳杆菌LP45抗氧化以及干预巨噬细胞产生的细胞因子与成骨/破骨细胞分化和凋亡的关系,并解析LP45拮抗糖皮质激素诱导的破骨细胞、成骨细胞功能改变以及氧化应激反应的机制,从而在分子水平阐明植物乳杆菌LP45干预骨质疏松的相关机理,为骨质疏松症的早期预防提供新的科学依据及新方式。方法:1.以巨噬细胞RAW264.7为实验对象,将其分为LPS组、LP45组、LPS+LP45组、空白对照组,采用氧化应激探针染色检测细胞内氧化应激指标水平,采用蛋白免疫印迹法检测NOX4、P22、P47氧化应激相关蛋白表达水平以及IL-1β、NLRP3、IRF3、INF-β炎性因子相关蛋白表达水平,采用ELISA法检测MDA和SOD的浓度。2.使用Traswell小室完成巨噬细胞—成骨细胞培养体系及巨噬细胞—破骨细胞培养体系的建立,将其分为LPS组、LP45组、LPS+LP45组、空白对照组,采用免疫荧光染色检测RANKL表达,采用蛋白免疫印迹法检测OPG、RANKL、RUNX3、β-catenin成骨细胞相关蛋白表达量以及N F-κB、CREB、AP-1破骨细胞蛋白表达水平,采用CCK-8法检测成骨细胞增殖能力。结果:1.各组RAW264.7巨噬细胞氧化应激水平结果显示:荧光显微镜观察发现,与空白对照组相比,LPS组ROS水平明显降低(P<0.01);与LP45组相比,LPS组、LPS+LP45组ROS水平明显升高(P<0.01);与LPS组相比,LPS+LP45组ROS的产生明显降低(P<0.01);ELISA检测结果显示,与空白对照组相比,LP45组MDA水平下降,SOD水平明显升高(P<0.01);与LP45组相比,LPS组、LPS+LP45组MDA水平明显升高,SOD水平明显降低(P<0.Aeromonas veronii biovar Sobria01);与LPS组相比,LPS+LP45组MDA水平明显降低,SOD水平明显升高(P<0.01)。2.各组RAW264.7巨噬细胞氧化应激相关蛋白表达结果显示:与空白对照组相比,LP45组NOX4、P47表达量降低(P<0.01),LP45组P47表达量显著降低(P<0.01);与LP45组相比,LPS组、LPS+LP45组N OX4、P22、P47的表达量均显著增加(P<0.01);与LPS组相比,LPS+LP45组NOX4、P22、P47的表达量均显著降低(P<0.01);与LP45组相比,LPS+LP45组NOX4、P22、P47的表达量仍然较高(P<0.01)。3.各组巨噬细胞SHP2结果显示:与LP45组点击此处相比,LPS组、LP45+LPS组SHP2表达水平显著下降(P<0.01);与LPS组相比,LP45+LP S组SHP2表达水平显著上升(P<0.01);各组炎性因子相关蛋白表达水平结果显示:与LP45组相比,LPS组、LP45+LPS组IL-1β、NLRP3、I RF3、INF-β表达水平显著上升(P<0.01);与LPS组相比,LP45+LPS组L-1β、NLRP3、IRF3、INF-β表达受到抑制,表达水平显著下降(P<0.01)。4.各组成骨细胞活性及RANKL免疫荧光染色结果显示:CCK检测法检测成骨细胞活性发现,培养48h后空白对照组、LPS组与LP45组之间细胞活性有显著差异(P<0.01);采用免疫荧光实验观察RANKL的表达结果显示,与空白对照组相比,LP45组成骨细胞RANKL表达量明显降低(P<0.01);与LP45组相比,LPS组、LPS+LP45组其表达量明显升高(P<0.01);与LPS组相比,LPS+LP45组表达量明显降低(P<0.01)。5.各组成骨细胞相关蛋白表达水平结果显示:与LP45组相比,LP S组、LP45+LPS组的RANKL表达水平明显上升(P<0.01);与LPS组相比,LP45+LPS组Etoposide配制的RANKL表达水平明显下降(P<0.01);与空白对照组相比,LP45组OPG、RANKL、RUNX3表达水平明显升高(P<0.01);与LP45组相比,LPS组、LP45+LPS组的OPG、RANKL、RUNX3表达水平明显下降(P<0.01);与LPS组相比,LP45+LPS组的OPG、RANK L表达水平明显下降(P<0.01)。6.各组破骨细胞相关蛋白的表达水平结果显示:与空白对照组相比,LP45组NF-κB、CREB、AP-1表达水平显著降低(P<0.01);与LP45组相比,加入LPS后,LPS组、LP45+LPS组的NF-κB、CREB、AP-1表达水平明显上升(P<0.01);与LPS组相比,LP45+LPS组的NF-κB、C REB表达水平明显下降(P<0.01),AP-1表达水平下降(P<0.05)。结论:LPS通过介导产生氧化应激,降解SHP2和相关激酶活化破坏成骨细胞分化、促进破骨细胞生成。LP45可以通过抑制氧化应激的产生及炎症因子的产生,发挥抗氧化及抗炎作用,以激活SHP2信号通路,促进成骨细胞分化、抑制破骨细胞生成从而维持骨稳态、改善骨代谢。

最新的全球癌症负担数据显示,结直肠癌已成为全球最为常见的癌症之一,排名第三。在我国,结直肠癌的发病率和死亡率正呈上升趋势,最新的国家癌症中心统计数据表明,它已成为恶性肿瘤中发病率第二高和死亡率第四高的癌症。因此,探索安全、高效的结直肠癌治疗方法具有重大意义。化疗过程中,易产生肿瘤耐药性,而在使用免疫药物时,常出现免疫逃逸和免疫耐受,易造成肿瘤恶性转移。结肠癌作为一种实体瘤血管异常繁杂,血液供氧不足。同时,肿瘤细胞代谢旺盛,进一步加剧缺氧状况。因此,针对肿瘤乏氧以及化疗耐药性,纳米药物递送系统的治疗效果日益显著。目的:1.探讨如何克服结肠中的细胞外基质和粘液的阻碍,以便更多的纳米药物能够富集到结肠癌部位,并且探讨纳米马达跨越肠道屏障的机制。2.探讨如何通过超声驱动纳米马达来促进肿瘤细胞产生铁死亡,从而发挥抗肿瘤免疫效应,并且探讨超声驱动纳米马达产生铁死亡的机制。3.探讨如何通过超声驱动口服纳米马达克服肿瘤乏氧环境,从而增强的超声动力学效应来对抗肿瘤的复发和转移。4.探讨如何通过避免肿瘤免疫治疗中的免疫逃逸和免疫耐受,预防原位结肠癌复发和转移的潜在抗肿瘤免疫机制。方法:1.纳米马达(GNE-140抑制剂CS-ID@NMs)的制备和表征。蚕茧中提取再生丝素蛋白。制备介孔二氧化锰纳米材料Barasertib半抑制浓度。通过溶剂挥发法对介孔二氧化锰进行表面修饰丝素蛋白材料。通过经典的酰胺化反应,在丝素蛋白表面修饰硫酸软骨素分子,以实现对结肠癌的靶向。使用动态光散射技术对CS-ID@NMs的粒径和电位进行分析表征。通过傅里叶红外光谱(Fourier Transform infrared spectroscopy,FTIR)和X射线衍射(X-ray Diffraction,XRD)对CS-ID@NMs进行蛋白质二级结构分析。采用传统透析法研究纳米马达的释药响应行为。2.超声驱动CS-ID@NMs的体外抗肿瘤实验。使用MTT(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测超声驱动CS-ID@NMs的抗肿瘤活性。研究超声驱动CS-ID@NMs的结肠癌细胞的靶向吞噬和溶酶体逃逸情况。CS-ID@NMs释放声敏剂的线粒体靶向情况。超声驱动CS-ID@NMs对肿瘤细胞的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶4和脂质过氧化(Lipid peroxide,LPO)的含量变化情况。超声驱动CS-ID@NMs的抗肿瘤免疫性能,高迁移率族蛋白1(High Mobility Group Protein B1,HMGB1)和钙网蛋白(Calreticulin,CRT)的含量变化。超声驱动靶向纳米马达的肿瘤球渗透性能。3.多功能CS-ID@NMs的生物分布和生物安全性评价。采用动物荧光成像系统拍摄CS-ID@NMs在五脏器官(心、肝、脾、肺和肾)以及胃肠道(胃、十二指肠、空肠、回场、盲肠和结肠)的荧光图像。采用共聚焦显微镜拍摄超声驱动纳米马达在结肠组织的结肠癌靶向吞噬现象。不同剂量的CS-ID@NMs在口服后体重变化和器官指数变化,五脏器官(心、肝、脾、肺和肾)和胃肠道(胃、十二指肠、空肠、回场、盲肠和结肠)的病理切片,以及血常规分析。4.超声驱动CS-ID@NMs对原位结肠癌的抑制以及防止复发和转移。超声驱动CS-ID@NMs联合Anti-PD-L1(Anti-programmed cell death-Ligand 1)治疗原位结肠癌小鼠。治疗结束后对小鼠结肠肿瘤的大小进行定量分析。收集血清进行炎症因子(Tumor necrosis factorα,TNF-α和Interferonγ,INF-γ)的测量。收集五脏(心、肝、脾、肺和肾)和结肠用于苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining,H&E)染色。结肠癌组织进行细胞增殖(Ki67)染色,凋亡(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP-biotin nick end labeling,TUNEL)染色和免疫荧光染色(CD4、CD8、Foxp3和Hypoxia indmedicine containersucible factor-1,HIF1-α)。超声驱动CS-ID@NMs对原位结肠癌治疗小鼠的胸腺中树突细胞和脾脏中的免疫细胞的含量(CD4~+T细胞和CD8~+T细胞)以及初始记忆T细胞,前效应T细胞,中心记忆T细胞,效应记忆T细胞的含量。在转移瘤治疗预防过程中,记录肿瘤的体积大小。收集远端肿瘤组织进行H&E染色、细胞增殖(Ki67)染色,凋亡染色和免疫荧光染色(CD4、CD8和Foxp3)。结果:1.通过在介孔二氧化锰表面修饰丝素蛋白和硫酸软骨素,成功地制备出了平均粒径为212.3 nm,表面电位为-27.3 m V的CS-ID@NMs。此外,在模拟结肠液中具有良好的稳定性。在介孔二氧化锰材料的表面修饰过程中,相对游离的丝素蛋白,CS-ID@NMs形成了更多的β折叠结构。通过释药实验的探究,发现穿越型纳米马达具有多种刺激(酸碱度、谷胱甘肽、活性氧和超声)响应性释药特性。2.超声和靶向硫酸软骨素分子修饰均提高了纳米马达被肿瘤细胞的靶向吞噬。CS-ID@NMs释放的声敏剂具有线粒体靶向的性能。超声促进纳米马达的溶酶体逃逸性能。超声驱动CS-ID@NMs增强肿瘤细胞的活性氧含量、GSH的耗竭和GPX4的下调现象。超声驱动CS-ID@NMs促进了HMGB1的释放和CRT的暴露现象。超声促进纳米马达的肿瘤球靶向渗透。3.超声促进纳米马达跨越肠道屏障,并且可以提高纳米马达在结肠癌组织特异性靶向摄取。口服递送纳米马达后,体重和器官指数没有发生异常变化,没有对主要的器官(心,肝,脾,肺,肾)和胃肠道组织(胃,十二指肠,空肠,回肠,盲肠,结肠)造成损伤,没有明显的血液学变化。4.超声驱动CS-ID@NMs联合Anti-PD-L1治疗抑制原位结肠癌的增殖,而且结肠病理切片的组织学评分最低,凋亡细胞含量最多和增殖细胞最低。并且促进胸腺中树突细胞的成熟最多和促进脾脏中的CD8~+T细胞的增殖和分化最多,CD8效应记忆T细胞的含量最多。同时血清中炎症因子(TNF-α和INF-γ)含量均最多。结肠部位的免疫荧光中发现超声驱动的CS-ID@NMs联合Anti-PD-L1治疗促进了CD8~+T细胞的增殖和分化最多和免疫抑制细胞最少并且HIF1-α含量最低。超声驱动的CS-ID@NMs联合Anti-PD-L1治疗有效预防结肠癌的发生和转移。转移瘤免疫荧光切片中,发现超声驱动的CS-ID@NMs联合Anti-PD-L1治疗促进转移瘤组织的凋亡细胞最多和增殖细胞最低。并且促进了CD8~+T细胞在转移瘤组织中的增殖和分化最多和免疫抑制细胞最少。结论:在本研究中,介孔二氧化锰负载声敏剂,表面经过丝素蛋白和硫酸软骨素的修饰,具有肿瘤微环境多重刺激响应性药物释放(酸碱度、谷胱甘肽、活性氧和超声),从而实现肿瘤部位精确定点可控药物释放。在超声和过氧化氢的双驱动下,CS-ID@NMs可有效跨越肠道屏障,特异性靶向聚集于结肠肿癌细胞。超声驱动CS-ID@NMs联合Anti-PD-L1治疗可以有效的发挥抗肿瘤免疫治疗模式,并且促进树突细胞的成熟,并且增加CD8~+T细胞的增殖和分化,并且减少调节性T细胞的增殖和分化,促进初始记忆T细胞增殖和分化为前效应T细胞,中心记忆T细胞,最终分化为效应记忆T细胞来是行使抗肿瘤免疫治疗,进而刺激机体产生免疫记忆效应,从而有效抑制原位结肠肿瘤和恶性转移肿瘤。

癌症是一种致死率高的疾病,危害人们的生命健康,所以急需开发新的癌症诊断和治疗技术。化疗药物DOX作为治疗癌症的常规手段,副作用大且长期服用易导致耐药性。如何克服癌细胞耐药性并实现DOX靶向精准递送,以及药物可控快速释放对于癌症治疗至关重要。现有的无机/有机纳米材料作为DOX药物载体通过化学键连接负载DOX进入癌细胞内,但无法区分正常细胞实现靶向精准递送;DNA纳米材料通过物理嵌插负载DOX并通过粘性末端杂交连接适体,适体能够识别癌细胞表面过表达的蛋白实现药物靶向递送,但只能依赖于肿瘤细胞内的酸性环境被动降解DNA来实现DOX的释放;仅采用化疗手段无法解决耐药性难题,还需要引入基因治疗手段克服耐药性。银纳米簇荧光稳定性好,可用于药物载体细胞内SB431542定位。因此,我们致力于开发一种多功能药物递送载体,可同时运载化疗药物和核酸药物靶向进入特定癌细胞,整个运输进入细胞的过程和最后药物的释放过程可通过荧光信号监控,从而最终实现对癌细胞的化疗和基因协同治疗。本研究主要包括以下内容:(1)DNA纳米花结合银纳米簇用于癌细胞成像及药物靶向递送第一部分中,我们以滚环扩增反应(RCA)制备DNA纳米花作为药物递送载体,将化疗药物DOX、miRNA-21和MDR1 mRNA的反义核酸(ASO)送入癌细胞中实现化疗和基因协同治疗。首先,DNA纳米花尺寸可控,DNA纳米花外层DNA中含有Sgc8适体能够识别癌细胞表面PTK7蛋白从而实现靶向递送,改变纳米花表面适体种类能靶向多种癌细胞使其作为通用型药物载体。其次,乳腺癌耐药性细胞内过表达的miRNA-21与癌细胞增殖有关,MDR1 mRNA调控P-gp耐药蛋白过表达使癌细胞产生耐药性,我们针对性地负载miRNA-21和MDR1 mRNA的反义核酸实现基因治疗下调相关蛋白表达。我们将C1(miRNA-21 ASO)/C2,C3(MDR1 mRNAASO)/C4分别与纳米花表面DNA形成三条链共杂交的three way junction结构,负载核酸药物的同时有利于DOX嵌入该结构中的CG碱基对中,DOX负载率达到93%。癌细胞内的miRNA-21和MDR1 mRNA分别与C1、C3杂交,导致三链结构解组装触发DOX释放,DOX释放率达到83%。同时,miRNA-21和MDR1 mRNA与其对应的反义核酸杂交会产生“绿色荧光打开,红色荧光关闭”的荧光信号变化,缓冲液中靶标miRNA-21和MDR1 mRNA的浓度在0-500 n M内具有良好线性关系,在癌细胞荧光成像中观察到miRNA-21和MDR1 mRNA介导的荧光信号切换,成功实现miRNA-21和MDR1 mRNA细胞成像。最后,我们将DOX介导的化疗与反义核酸介导的基因治疗有机结合Z-IETD-FMK,减少了癌细胞内DOX外排,有利于更多的DOX药物分子在细胞内充分发挥化疗作用。细胞毒性实验表明负载miRNA-21/MDR1 mRNA ASO及化疗药物DOX的纳米花复合载药体系对正常细胞无影响,对癌细胞杀伤率达60%。纳米花复合载药体系实现了药物靶向精准递送、可控快速释放,对癌细胞具有较好地杀伤效果。(2)基于滚环扩增反应构建荧光生物传感器用于检测microRNA第一部分中,我们在体外检测肿瘤标志物miRNA-21,但是未引入信号放大技术,不利于低浓度靶标miRNA-21的灵敏检测。同时,链置换等无酶信号放大技术存在较高的假阳性背景信号,而酶具有较高的催化活性能够识别切割特定位点。因此,在第二部分中,我们提出APE1酶辅助靶标循环结合滚环扩增反应(RCA)构建双重信号放大的荧光生物传感器用于高灵敏度检测miRNA-21。我们设计的发夹HP环上有一个AP位点,HP单独存在时不会被APE1酶切开,靶标miRNA-21与HP环杂交形成双链后AP位点被APE1酶切开,HP分裂成HP1和HP2两部分并分离。同时,释放的靶标miRNA-21继续参与下一个循环反应触发新的HPimpulsivity psychopathology被酶切断裂,HP1与哑铃型环状模板DP杂交用于引发RCA反应,RCA反应得到含有多重G四联体重复单元的DNA长链。随后,我们在滚环扩增产物先加入K~+形成G四联体结构,再加入硫磺素T,G四联体增强硫磺素T荧光输出荧光检测信号。该检测方法在靶标miRNA-21浓度0.1-100 n M范围内具有良好的检测性能,检测限低至3.3 p M,具有良好的特异性,并在人血清样本中实现miRNA-21精准检测。

丝胶蛋白是家蚕分泌的一种天然蛋白,不仅具有保湿、抗炎、抗氧化及高生物相容性和无免疫原性等特点,而且拥有丰富且便于修饰和改造的活性基团,是制备生物医用水凝胶的极好材料。近年来,研究者已制备了多种丝胶蛋白水凝胶并将其用作药物或生长因子的递送载体、细胞支架及多种组织损伤修复。然而,现有丝胶蛋白水凝胶仍然存在机械强度差、除菌难、透明度低等问题。本论文分别从丝素缺失突变型家蚕的蚕茧和蚕体中提取丝胶蛋白,制备出了两种新型纯丝胶蛋白水凝胶,同时对其理化性能、生物相容性等进行了系统地表征,旨在解决目前丝胶蛋白水凝胶存在的不足并拓展丝胶蛋白水凝胶在组织工程等领域的应用。1.无菌、可注射且高机械性能丝胶蛋白水凝胶的制备及其性能研究本部分选取丝素缺失突变型家蚕(180 Nd-s)的蚕茧,洗净研磨成粉末,经过高温高压(121℃,0.1 MPa)处理后,即可获得高浓度、无菌且游离氨基含量高的丝胶蛋白溶液。然后将丝胶蛋白溶液与京尼平交联,制备了无菌、可注射、力学性能优异的丝胶蛋白水凝胶。该水凝胶体系可以通过调控丝胶蛋白溶液的浓度,实现了成胶时间在十几分钟至数小时范围内调控。不同浓度的丝胶蛋白水凝胶支架的孔径在4.9-7.1μm之间,孔隙率在66%-79%之间,其可调控的孔径可用于不同细胞的培养与组织修复;该丝胶蛋白水凝胶还具有优异的溶胀性和降解性,且其溶胀和降解均具有pH响应性,其中在碱性条件(pH 11.0)下最大溶胀率高达800%。在降解性测试中,丝胶蛋白水凝胶在碱性条件(pH 11.0)下降解速率最快、中性环境(pH 7.4)下次之,酸性环境(pH 3.0)下最慢,35天内累计降解率分别为85%、64%和25%;此外,水凝胶在小鼠体内可存留Histone Methyltransf抑制剂超过5周。该丝胶蛋白水凝胶还具有优良的机械性能,12%丝胶蛋白水凝胶的压缩模量为434 k Pa,且最大延展率可达740%,此时的拉伸强度为375k Pa;同时该丝胶蛋白水凝胶具有良好的注射性。此外,还具有良好的药物缓释功能,负载的模式药物辣根过氧化物酶(HRP)的释放可到192 h以上;在细胞相容性方面,该水凝胶能够支持小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)的黏附与增殖。以上结果说明,无菌、可注射、高机械性能的丝胶蛋白水凝胶有望作为一个多功能平台用于药物、生长因子或细胞的递送载体或用于组织损伤修复。2.高延展性的透明丝胶蛋白水凝胶的制备及其性能研究本部分通过解剖丝素缺失突变型家蚕(140 Nd-s),从蚕体内的丝腺中分离得到高浓度丝胶蛋白溶液。然后利用该丝胶蛋白溶液与甲酸作用,制备出具有高延展性且透明的新型丝胶蛋白水凝胶。该丝胶蛋白水凝胶具有多孔结构,孔径范围在15-33μm,孔immediate consultation隙率范围在69%-80%;它的溶胀率在200%-260%之间。与以往报道的水凝胶相比,该水凝胶在水溶液中的降解速度缓慢,在碱性条件(pFG-4592价格H 11.0)下,5周的累计降解率仅在25%左右,这可能与它含有较高的β-折叠结构以及其良好的稳定性有关。在机械性能方面,该丝胶蛋白水凝胶的最大延展率可达到853%,远高于已报道的纯丝胶蛋白水凝胶。另外其弹性模量为388 k Pa。此外,该丝胶蛋白水凝胶无细胞毒性,具备良好的细胞相容性。综上所述,该水凝胶有望成为可视化创伤敷料以及一些对力学性能要求较高的软组织损伤修复等方面的候选材料。

为研究不同饲养方式对2月龄滩羊羔羊脂肪和肌肉组织脂肪酸组成和含量的影响，试验选择24只体重接近、健康的刚出生的滩羊羔羊随机分成舍饲和放牧组，每组滩羊羔羊各12只，放牧组羔羊随放牧哺乳母羊饲养，舍饲组随舍饲哺乳母羊饲养，于2月龄时屠宰取膈肌、股二头肌、背最长肌、尾部脂肪、肾周脂肪和皮下脂肪，用气相色谱仪测定脂肪酸含量。试验结果表明：（1）在肌肉组织的脂肪酸中，与放牧组相比，舍饲组滩羊膈肌中棕榈酸、花生酸、反式油酸的含量显著提高（P <0.05）；硬脂酸、油酸、亚油酸的含量极显著提高（P <0.01）,α-亚麻酸、二十碳五烯酸甲酯（EPA）、二十二碳六烯酸甲酯（DHA）的Anaerobic biodegradation含量极显著降低（P <0.01）。股二头肌中肉豆蔻酸、棕榈酸、亚油酸的含量极显著提高（P <0.01）,α-亚麻酸的含量极显著降低（P <0.01）。背最长肌中花生酸的含量显著降低（P <0.05），花生四烯酸的含量显著提高（P <0.05）；棕榈酸、反式油酸的含量极显著提高（P <0.01）,α-亚麻酸、EPMLN8237配制A、DHA的含量极显著降低（P <0.01）。（2）在脂肪组织的脂肪酸中，与放牧组相比，舍饲组滩羊Dibutyryl-cAMP尾部脂肪的硬脂酸、反式油酸、亚油酸的含量极显著提高（P <0.01）,α-亚麻酸含量极显著降低（P <0.01）。肾周脂肪的硬脂酸、反式油酸、亚油酸含量极显著提高（P <0.01）,α-亚麻酸含量极显著降低（P <0.01）。皮下脂肪的肉豆蔻酸、花生酸、α-亚麻酸的含量极显著降低（P <0.01）。综上，不同饲养方式滩羊羔羊肌肉组织和脂肪组织的脂肪酸含量不同。

胃癌因其发病率高、恶性程度高、确诊时期晚等特点,成为世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。针对胃癌的治疗按照不同分型分期,应用手术、化疗、放疗以及辅助治疗等方案相互结合进行,其中化疗则是重要的一项治疗手段。但随着化疗药物使用次数增多以及患者的个体差异性等因素的影响,胃癌患者对化疗药物敏感性降低,产生耐药的现象逐渐增多,使得化疗耐药成为影响胃癌患者预后的重要因素之一。然而,患者是否对某一药物耐药目前还没有有效的评判标准,使得耐药判断呈现滞后性高、无法及时寻找替代药物等特点。随着化疗耐药的研究不断深入,越来越多的证据表明胃癌患者化疗耐药的发生常与癌基因或抑癌基因的表达改变、癌细胞的药物代谢和抵抗作用以及患者反复多次用药等因素相关。我们的前期研究证明,胰岛素增强子结合蛋白1(Insulin gene enhancer binding protein 1,ISL1)在胃癌中异常表达,ISL1不仅参与胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,还可以作为判断genetic interaction胃癌患者预后的重要指标,说明ISL1与胃癌的发生发展有密切的关系。但ISL1对胃癌中的化疗敏感性的影响以及具体机制目前还未见报道。【目的】本研究旨在探究ISL1对胃癌细胞化疗敏感性的影响,并尝试阐述ISL1调控化疗敏感性的具体分子机制。【方法】1.通过免疫组化检测化疗(或铂类)耐药/VX-661细胞培养敏感患者的肿瘤组织中ISL1的表达,并联系临床病理特征分析ISL1与胃癌患者化疗(或铂类)耐药的关系。2.通过Western blot、RT-q PCR实验检测胃癌细胞系MGC803、MKN45、BGC823、AGS、SGC7901和正常胃黏膜上皮细胞系GES1中ISL1的表达水平,筛选ISL1相对高表达和相对低表达的细胞系作为后续的研究体系。3.通过RT-q PCR和Western blot实验检测不同浓度顺铂(0、20、Belnacasan40、60、80、100μM)作用下ISL1的m RNA水平和蛋白水平的表达量。利用CCK8实验检测通过转染ISL1敲低或过表达的质粒后胃癌细胞的顺铂IC50的变化。此外,检测ISL1对顺铂作用下胃癌细胞增殖能力的影响,综合分析ISL1与顺铂敏感性的关系。4.对敲低ISL1的胃癌细胞CHIP-seq的差异基因数据集进行GO分析和KEGG pathway富集分析,定位ISL1参与胃癌耐药的相关机制。根据ISL1参与胃癌耐药机制的结果,进行ISL1与自噬的关系验证。利用MDC染色、m GFP-RFP-LC3荧光以及Western Blot检测自噬指标蛋白联合监测ISL1作用下胃癌细胞自噬流的变化情况,同时利用自噬调节剂进行回复。利用自噬调节剂处理ISL1敲低/过表达稳转胃癌细胞研究胃癌细胞增殖能力的变化。结合上述实验,综合分析ISL1对胃癌细胞自噬流的影响。5.对顺铂处理后的两株胃癌实验细胞进行自噬的检测,分析顺铂对胃癌细胞自噬的影响。ISL1敲低或过表达的同时联合自噬调节剂,观察此时胃癌细胞IC50的变化,以及在ISL1的改变、自噬调节剂的加持下,检测顺铂抑制胃癌细胞增殖的能力,分析是否产生差异性的改变。结合以上实验,分析ISL1是否通过促进保护性自噬抑制胃癌细胞顺铂敏感性。6.利用自噬相关基因PCR array和Chip-seq数据联合分析ISL1可能调控的下游基因,并探究ISL1能否结合到ATG9B的转录增强子区域,并寻找结合位点。同时对ISL1敲低或过表达,利用RT-q PCR、Western Blot分析ATG9B m RNA水平以及蛋白水平的表达变化。【结果】1.通过免疫组化及临床病理分析结果发现ISL1高表达的胃癌患者发生化疗(或铂类)耐药的可能性增加,同时通过RT-q PCR、Western Blot检测发现ISL1表达丰度与胃癌细胞顺铂敏感性呈负相关。此外,通过IC50检测发现ISL1的高表达可以降低胃癌细胞对顺铂的敏感性,从而提高胃癌细胞对于顺铂的抵抗效应。2.通过GO分析和KEGG pathway富集分析,我们分析ISL1的表达与细胞对外界的刺激反应有关,该数据集内自噬相关基因占半数,同时ISL1还与自噬前驱通路PI3K/AKT相关。因此我们将研究机制定位至胃癌细胞的自噬过程。通过MDC染色、m GFP-RFP-LC3荧光以及Western Blot检测自噬指标蛋白联合检测,发现ISL1表达升高使自噬小体、自噬指标蛋白表达增加;而ISL1表达降低,使自噬小体、自噬指标蛋白表达随之降低,同时自噬调节剂在ISL1表达改变的影响下无法有效发挥原本的作用。3.通过IC50检测发现,过表达ISL1可以降低胃癌细胞的顺铂敏感性,联用自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)后可以使敏感性进一步降低;而联用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)细胞的敏感性被部分恢复,有所增强。相反的,敲低ISL1可以增强胃癌细胞的顺铂敏感性,联用3-MA可以进一步增强胃癌细胞顺铂敏感性,联用Rapa则降低胃癌细胞的顺铂敏感性。而CCK8增殖实验结果显示,顺铂能够有效抑制胃癌细胞的增殖。Rapa部分恢复顺铂作用下胃癌细胞的增殖能力,而过表达ISL1后,Rapa的作用得到进一步加强;敲低ISL1后,Rapa无法有效恢复顺铂作用下胃癌细胞的增殖能力。3-MA可以增强顺铂抑制胃癌细胞增殖的作用,即3-MA发挥了促敏顺铂的作用,敲低ISL1后,3-MA的顺铂促敏作用被进一步增强;过表达ISL1后,3MA的顺铂促敏作用被部分抑制,胃癌细胞的增殖能力有所恢复。4.通过RT-q PCR、Western Blot、Chip-seq结果联合分析提示,自噬相关蛋白9B(Autophagy Related 9B,ATG9B)有可能是ISL1的下游靶基因,ISL1可能直接结合在ATG9B基因的增强子区,促进其m RNA的表达,但对ATG9B蛋白水平表达调控作用不明显。【结论】1.ISL1在癌组织和细胞系中异常高表达,ISL1高表达的胃癌患者发生化疗耐药及铂类耐药可能性增加。ISL1通过促进细胞的保护性自噬来降低胃癌细胞的顺铂敏感性,从而提高胃癌细胞对顺铂的抵抗能力,且ISL1的表达与顺铂浓度呈负相关。2.ISL1促进胃癌细胞自噬的发生,主要体现在自噬的启动和激活阶段,且ISL1对自噬的调节作用可能通过ATG9B介导的。