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目的解析铁自噬Clinical forensic medicine在锑诱导神经元铁死亡中的作用及机制。方法建立小鼠锑体内暴露模型及PC12细胞体外暴露模型,结合铁死selleckchem亡特异性抑制剂Fer-1干预模型,通过免疫荧光、免疫组化、荧光探针及免疫印迹等方法检测铁死亡相关指标及小鼠神经损伤与细胞毒性相关指标,明确神经元铁死亡在锑诱导的神经毒性中的作用。体内外检测铁蛋白的表达和降解速率,结合自噬抑制模型,明确锑对神经元铁自噬的影响。构建腺病毒载体,特异性在小鼠神经元上过表达FTH1蛋白,体内外干预自噬,在此基础上构建锑暴露模型,检测细胞和动物模型中海马区神经元铁离子浓度,铁死亡经典生化和分子指标,明确铁自噬在锑诱导神经元铁死亡中的关键作用。最后,通过基因干扰,鉴定锑暴露后介导铁蛋白降解的自噬受体。结果锑暴露可诱导小鼠海马区神经元和Liproxstatin-1配制PC12细胞发生铁死亡,抑制铁死亡有效降低锑的神经毒性。锑暴露促进铁蛋白降解,过表达铁蛋白及抑制自噬可显著抑制锑诱导的神经元铁死亡。抑制NCOA4有效抑制锑暴露介导的铁蛋白降解和铁死亡。结论锑通过NCOA4依赖的方式激活铁自噬导致神经元细胞铁死亡。

目的:探讨子宫内膜癌相关错配修复基因突变情况、微卫星状态及二者与临床病理特征关系,发现与MMR相Pexidartinib关的高频突变基因及MMR基因新的突变位点,为子宫内膜癌的治疗寻找有效新靶点,指导临床对患者进行个性化治疗。方法:选取2014年12月-2021年3月北部战区总医院244例子宫内膜癌患者活检组织,采用芯片捕获测序方法检测子宫内膜癌相关的212个基因突变情况及MSI检测,免疫组化法对48例全子宫切除标本的错配修复蛋白进行检测。结果:244例子宫内膜癌样本中有160例发生MMR基因突变,160例样本共发生3602次基因突变,MLH1、MSH2、MSH6、PMS2突变病例占比依次为25%(40/160)、45.6%(73/160)、37.5%(60/160)、25%(40/160),MSH2突变频次最高。MMR突变伴发高频突变基因前15位分别为PTEN、BIRC5、ARID1A、PIK3CA、TSC2、BRCA2Unlinked biotic predictors、CTNNB1、PIK3R1、POLE、ATM、AXIN2、CHD4、IRS2、COL11A2、ARMCX4。单因素分析结果表明,IRS2、CHD4、CTCF基因变异在MMR突变组与MMR未突变组存在差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。MLH1、MSH2、MSH6、PMS2发生的致病性突变位点(57)和可能致病突变位点(25)分别为1.8%(1/57)与16%(4/25)、24.6%(14/57)与28%(7/25)、68.4%(39/57)与48%(12Bafilomycin A1化学结构/25)、5.3%(3/57)与8%(2/25),MSH6发生致病性突变最多。MLH1、MSH2、MSH6、PMS2共发现29个新发致病位点(11)与可能致病位点(18),分别为0与5.6%(1/18),18.2%(2/11)与33.3%(6/18),72.7%(8/11)与50%(9/18),9.1%(1/11)与11.1%(2/18)。MMR蛋白表达缺失组与MMR蛋白表达正常组,在组织学分级、淋巴结转移组间对照差异显著,具有统计学意义(P<0.05),在年龄、病理分型、肌层浸润、脉管浸润组间对照差异不明显,没有统计学意义(P>0.05);微卫星高度不稳定性在子宫内膜癌的组织学分级、淋巴结转移差异明显,具有统计学意义(P<0.05)。结论:MMR缺陷、微卫星高度不稳定与子宫内膜癌的发展和预后密切相关,且MMR蛋白表达缺失、微卫星不稳定与子宫内膜癌的组织学分级、淋巴结转移呈正相关,因此检测MMR及微卫星状态对子宫内膜癌的临床治疗具有一定意义。

目的:探讨阿扎胞苷联合CAG方案治疗老年急性髓系白血病(acute myeloid PF-03084014供应商leukemia, AML)的临床治疗效果及治疗后对血液学指标的影响和安全性。方法:101例研究对象选自我院2019年01月至2022年01月接诊的老年AML患者，随机分为联合组(n=55)和对照组(n=46),联合组老年AML患者予以阿扎胞苷联合CAG方案治疗，对照组老年AML患者予以单一CAG方案治疗。对比两组老年AML患者临床治疗效果、血液学指标白细胞计数(WBC)、血红蛋白(Hb)、血小板计数(PC)、中性粒细胞恢复时间、血小板输注量、血小板恢复时间、安全性、生存质量评分。结果:经28 d治疗后，联合组老年AML患者总缓解率高于对照组老年AML患者(90.91%vs 63.04%)(P<0.05FG-4592分子式);联合组WBC和PC高于对照组，而联合组Hb低于对照组(P<0.05);联合组老年AML患者血小板输注量、血小板恢复时间及中性粒细胞恢复时间均低于对照组老年AML患者(P<0.05);联合组和对照组老年AML患者总不良反应率对比无显著差异(14.55%vs 15.22%)(P>0.05);联合组老年AML患者生存质量评分高于对照组老年AML患者(P<0.05);联合组术后1年生存率72.73%(40/55)明显高于对照组52.17%(24/46)(P<0.05)。结论:CAG方案联合阿扎胞苷治疗对老年AML患者具有较高的安全性，且能够改善患者血液学指标，减少血小板输注量，缩短血小板恢复时间及中性粒细胞恢复时caveolae mediated transcytosis间。同时联合治疗还可能增加患者生存时间。

目的 探讨黄芩苷通过抑制PGE2对脑缺血再灌注损伤（CIRI）小鼠神经炎症及认知功能障碍的影响。方法 成年雄性C57BL/6J小鼠随机分组，行短暂双侧颈总动脉闭塞（tBCCAO）造模，给予黄芩苷灌胃或侧脑室注射PGE2干预。水迷宫检测小鼠认知功能；ELISA测定术后72 h海马脂质过氧化及神经炎症水平；HE染色观察脑组织病理改变；Western blot检测海马铁死亡相关蛋白GPX4、DMT1、PTGS2表达。结果 CIRI引起小鼠认知功能损害，并伴随海马神经元损伤、神经炎症、脂质过氧化及铁死亡相关蛋白异常表达（P <0.05）；黄芩苷预处理可改善CIRI引起的认知功能损害，并伴随海马神经元损伤减轻，神经炎症、脂质过氧化、铁死亡相关蛋白异常表达减少（P <0.05）。侧脑室注射PGE2后小鼠海马PGE2上调，并伴随海马神经炎症、脂质过D-Lin-MC3-DMA体外氧化、铁死亡相关蛋白异常表达（P <0.05）；黄芩苷通过抑制PGE2上调减少海马神经炎症、脂质过氧化、铁死亡相关蛋白异常表达（P <0.05）。海马PGE2上调加重CIRI引起的小鼠认知障碍（P <0.05）；黄芩苷通过抑制PGE2的上调改善认知功能损害（P <0.05）。结论 黄芩苷selleck Y-27632改善CIRI引起的认知功能损害，其机制与PGE2相关的神经炎症被抑intracellular biophysics制有关。

癌症是全球第二大死亡原因,进行早期诊断和寻找适合的治疗方案对提高患者生存率和预后具有重要意义。目前,通过靶向肿瘤细胞过表达或者特异性表达的靶标分子的靶向治疗方案被认为是最有前景的治疗策略。然而,肿瘤细胞的异质性和突变性往往导致靶向治疗的失败,并且靶标分子的表达存在很大的个体差异,单一的靶点在治疗过程中易发生脱靶现象,迫切需要丰富肿瘤多靶点治疗的新靶点。糖胺聚糖(Glycosaminoglycans,GAGs)广泛分布在哺乳动物细胞表面和细胞外基质中,其合成不受gnotobiotic mice模板驱动,具有高度的时空特异性,异常表达与肿瘤的发生密切相关,是一种潜在的靶点。本论文以rVAR2基因序列为模板进行随机突变,经噬菌体展示技术构建突变体库,以肿瘤GAGs(如HepG2-GAGs)为靶标分子,建立了专一性筛选特异性识别肿瘤GAGs特殊结构探针的新方法,在对探针的特异性和识别表位的结构特征进行深入研究的基础上,进一步探究了探针在癌症诊断和治疗方面的潜在应用价值。主要成果概述如下:1.肿瘤细胞GAGs结合探针的筛选及其特异性分析:为了筛选特异性识别肿瘤细胞GAGs的探针,我们建立一种新的策略。rVAR2基因序列经易错PCR聚合酶随机突变构建突变体基因文库,用噬菌体展示技术表达突变体,利用固定有HepG2-GAGs的磁珠进行高通量定向筛选。经多轮淘选获得的突变体的基因,用大肠杆菌系统表达后,用结合能力分析实验研究突变体克隆对HepG2-GAGs的结合能力,选择结合能力最强的突变体,进一步在分子水平上进行与不同商品化GAGs的结合能力分析,并对其基因序列进行测序,比较与模板蛋白基因序列的差异,研究其改变的序列对结合能力的影响。最终,我们获得了一个与Hep特异性结合的突变体蛋白,将其命名为VAR2HP。SPR分析结果显示VAR2HP与Hep亲和常数达到38 nM,与HepG2-GAGs亲和常数达到30 nM。VAR2HP基因序列含有1953 bp,编码651个氨基酸,理论分子量为73.07 KDa。与 rVAR2 相比,增加了一段氨基酸序列 L292C293Y294T295D296K297L298E299L300N301 和一个N312,两者共同促进了 VAR2HP对Hep的特异性结合。VAR2HP的成功获得,表明通过对已鉴定的GAGs识别探针基因序列进行随机突变,定向筛选具有其他GAGs特异结合能力的探针的策略是可行的,具有重要的实用价值。2.VAR2HP识别表位的结构特征分析:由于从细胞难以获得足够量的HepG2-GAGs用于精细结构分析,本研究利用同样可以与VAR2HP高亲和力相互作用的商品化Hep进行VAR2HP识别表位的结构特征分析。首先,Hep被部分酶解并结合凝胶过滤层析,制备一系列不同聚合度的Hep寡糖(UDP2到UDP16),竞争性抑制分析表明,UDP10是可以强烈抑制VAR2HP与Hep结合的最小聚合度寡糖。随后,Hep的UDP10组分被利用阴离子交换HPLC进一步分离,获得了 11个电荷密度依次升高的亚组分(P10-1到P10-11)。竞争性抑制实验表明,随着电荷密度的增加,这些亚组分对VAR2HP与Hep结合的抑制力逐渐增强,直至P10-7抑制力增加显著趋缓甚至出现波动,该结果意味着P10-7是可以与VAR2HP高亲和力相互作用的带有最低电荷密度的最小Hep结构。对11个十糖亚组分的二糖组成分析表明,三硫酸化二糖Hex2S(1-4)GlcNS6S随着寡糖电荷密度的增加而增加。最后,我们对能够与VAR2HP高亲和力结合的携带最少电荷的P10-7进行酶法测序,其基本序列为 HexA(l-4)GlcNS-HexA2S(1-4)GlcNS6S-HexA(1-4)GlcNS6S-HexA2S(1-4)GlcNS6S-HexA2S(1-4)GlcNS6S,表明 VAR2HP 能够识别 Hep 的最小表位是至少含有三个不连续三硫酸化Hex2S(1-4)GlcNS6S的十糖。这与已鉴定的识别Hep/硫酸乙酰肝素(HS)链的探针识别的表位不同,说明VAR2HP是一种特异性识别Hep/HS的新型探针。3.VAR2HP识别表位在细胞表面以及体内的表达情况研究:为了比较VAR2HP表位在正常细胞和肿瘤细胞表面的表达情况,我们首先对VAR2HP进行了生物素化(VAR2HP-Bio)和荧光标记(VAR2HP-FITC),并以之为探针分别利用细胞ELISA和流式细胞仪分析了 VAR2HP在各种固定化细胞和活细胞表面的结合情况。结果表明,VAR2HP与正常细胞结合较弱,而与多种肿瘤细胞强结合,并且VAR2HP在肿瘤细胞表面的结合可以被肝素酶(Heparinases,Hepases)对细胞预处理或者添加外源Hep强烈抑制,表明肿瘤细胞表面表达的Hep样结构卷入了与VAR2HP的结合。进一步,我们利用激光共聚焦实验对VAR2HP在肿瘤细胞表面与Hep样结构的特异性结合进行了可视化分析和确证。以上结果表明VAR2HP识别的Hep样表位能在多种肿瘤细胞中高表达,VAR2HP是一种潜在的针对不同肿瘤细胞的广谱型探针。我们对不同细胞表达的GAGs中HS的二糖组成进行了分析,结果显示,被分析的各种细胞所表达的HS中均含有Hex2S(1-4)GlcNS6S,但是可以与VAR2HP强烈结合的各种肿瘤细胞中表达了更高含量Hex2S(1-4)GlcNS6S,表明细胞中三硫酸化Hex2S(1-4)GlcNS6S的表达量是决定VAR2HP结合能力的重要因素之一。为了进一步研究VAR2HP表位在体内的表达情况,我们首先将VAR2HP-FITC经尾静脉注射到小鼠体内,通过观察各个器官的荧光强度研究VAR2HP表位在体内各器官的表达和分布情况。结果显示VAR2HP-FITC在复杂的体内环境中存在6小时以上仍然具有结合体内器官的能力,与体内肝脏、胃、肠道结合较强,对心脏、肾脏、脾脏结合较弱。而经过Hepases预处理的小鼠,在注射VAR2HP-FITC后,与各个器官的荧光染色明显减弱,而CSase ABC预处理对小鼠各器官的荧光染色无明显抑制,表明VAR2HP识别表位在多种器官中有不同的表达和分布,VAR2HP在复杂的体内环境中仍然能够保持特异性识别Hep样结构的生物活性,是一个稳定的蛋白探针。随后,通过提取各器官中的GAGs,并分析其中Hep/HS的二糖组成,我们发现肝脏、肾脏和胃中表达的Hep/HS含有相对更多的三硫酸化二糖Hex2S(1-4)GlcNS6S,这与VAR2HP倾向于结合肝脏、肾脏和胃及肠道的结果吻合,表明这些器官中含有更多能被VAR2HP识别的表位。接下来,为了研究VAR2HP对体内肿瘤的靶向性,VAR2HP-FITC经尾静脉注射到用鼠源乳腺癌细PEG300临床试验胞系4T1细胞构建的肺部荷瘤小鼠体内,活体成像结果显示VAR2HP在肝脏、肠道区NSC 127716溶解度域和成瘤的肺部区域荧光强度较高,取其肺部进行荧光强度检测,结果显示肺部肿瘤结节部分的荧光强度明显高于其癌旁组织,表明VAR2HP有望成为在体内复杂生理环境下选择性靶向肿瘤的探针和抗肿瘤药物载体。4.VAR2HP在靶向治疗方面的应用潜力初探:为了研究VAR2HP作为药物载体通过靶向肿瘤细胞中过表达的Hep样表位从而提高药物抗肿瘤活性的作用,我们首先分析了 VAR2HP作为药物载体结合细胞后的内吞情况,激光共聚焦分析结果显示,VAR2HP能够快速结合到细胞表面,并在45 min内化入细胞核,具有作为药物载体携带药物进入靶细胞的潜力。随后,我们将VAR2HP与广谱性抗癌药物盐酸阿霉素(Doxorubicin hydrochloride,DOX)进行偶联(VAR2HP-DOX),采用流式细胞术分析了 VAR2HP-DOX对肿瘤细胞的靶向性,结果显示VAR2HP-DOX能够在10 min内快速结合到细胞,尽管VAR2HP-DOX中DOX的含量仅仅相当于DOX组的十分之一,但其荧光强度显著高于DOX组,表明VAR2HP能够促进药物在肿瘤细胞富集。随后,我们分析了VAR2HP、VAR2HP-DOX以及DOX对不同细胞活力的影响,MTT结果显示VAR2HP单独作用于多种细胞系时,可以微弱地抑制细胞增殖,对肿瘤细胞抑制效果更好。DOX对所有测试细胞无论正常还是肿瘤细胞都有强致死作用,但是对4T1细胞的致死效果更明显。VAR2HP-DOX对正常细胞致死作用明显低于肿瘤细胞,作用24h时,VAR2HP-DOX对4T1细胞的IC50值达到(18.83±1.66)μg/ml,与DOX组相比其DOX的用量降低了30倍,而对正常细胞HEK 293T在该实验浓度下无法计算IC50值。以上研究结果表明,VAR2HP作为药物载体,对肿瘤细胞具有很好的靶向性,有利于减小药物对正常细胞的损伤。为了进一步研究VAR2HP-DOX在体内的抗肿瘤活性,对皮下接种4T1的荷瘤小鼠进行VAR2HP、VAR2HP-DOX以及DOX给药处理,结果显示VAR2HP-DOX能够显著抑制肿瘤生长,与DOX组相比,VAR2HP-DOX组在DOX剂量减少16倍的情况下仍然能达到同DOX组相似的治疗效果,并且在治疗过程中,注射VAR2HP-DOX的实验组,小鼠体重减轻明显低于DOX组,表明VAR2HP-DOX通过特异性靶向肿瘤组织能够明显减轻对正常组织的损伤,是一种可用于肿瘤靶向治疗的理想药物载体。5.VAR2HP在肿瘤诊断方面的初步分析:我们利用生物素化VAR2HP-Bio作为探针对来自临床的不同肿瘤组织石蜡切片进行免疫组化染色分析,结果显示VAR2HP-Bio对肝癌和乳腺癌组织的染色显著强于癌旁组织,并且该染色可以被添加的外源Hep竞争性抑制,表明VAR2HP识别的Hep样表位在临床肝癌和乳腺癌组织中过表达,可以作为肿瘤诊断和靶向治疗的潜在靶标分子。进一步,我们调查了 VAR2HP表位在临床肝癌病人血清中的表达情况及作为靶标分子用于肝癌诊断的可能性。首先,我们用固定VAR2HP的Sepharose 4 Fast Flow分离正常人(NL)、肝炎患者(CH)、肝细胞癌患者(HCC)临床血清样本中的Hep/HS并进行二糖组成分析,结果显示HCC患者血清中总 Hep/HS 含量达到 331.61 μg/ml,显著高于 NL 组(192.20 μg/ml)和 CH 组(197.29μg/ml),并且只有HCC血清中具有可以与VAR2HP特异性结合的Hep样结构,含量达到36.28 μg/ml,表明HCC患者血清中不仅Hep/HS过表达,而且存在能被VAR2HP识别的表位,有望作为血清标志物用于HCC的诊断。基于以上发现,我们建立了一种基于能量共振转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)原理进行肝癌诊断的诊断方法,通过检测VAR2HP-FITC与不同临床血清样本预混合后被GO淬灭后残留的荧光强度差异对血清中的VAR2HP识别表位定量,从而进行HCC诊断。结果显示HCC患者残留的荧光强度高于NL和CH,当HCC血清经Hepases处理后,残留荧光强度显著下降,表明HCC患者血清中含有更多的VAR2HP表位,与之结合后抑制了 GO对VAR2HP-FITC的淬灭。为了便于计算该方法的检出率,我们以VAR2HP-FITC在PBS缓冲液中被GO淬灭后残留的荧光强度为对照,实验组数据用相对于对照组的增长倍数表示,以CH血清残留荧光强度增长倍数加上两倍标准差作为HCC检出下限,检出率达到59.97%,临床上目前使用的HCC诊断血清标志物Glypican-3和AFP检出率也在60%左右,表明血清中特殊结构的Hep/HS能够作为HCC诊断的新靶点,并且利用该靶点进行HCC诊断是可行的,本文为HCC诊断提供了一种新的检测方法。综上所述,本论文建立了一种可以专门用于肿瘤相关GAGs特异性探针筛选的新策略和技术平台,利用该平台可以以已知的具有GAGs结合能力的蛋白为模板,通过随机突变,结合噬菌体展示和靶标GAGs的定向淘选,实现对已有GAGs探针的特异性优化的同时有目的筛选具有特异结构的GAGs的特异性探针,不仅可以满足复杂GAGs结构和功能研究及专一性分析检测对特异性探针的迫切需要,也可以为以GAGs为靶点的肿瘤诊断和靶向治疗提供亟需的专一性探针。本论文得到的特异性识别Hep样结构的探针VAR2HP,不仅为Hep的专一性检测提供了新型生物相容性探针,其能够识别的Hep样表位在多种肿瘤细胞中过表达,作为一种新GAGs类靶点,作为血清及肿瘤组织标志物,在相关肿瘤的肿瘤诊断和靶向治疗中具有重要的潜在应用价值。

葡D-Lin-MC3-DMA作用萄是世界上最重要的鲜食和加工果品之一,其果实味美多汁、经济效益高,深受消费者和生产者的喜爱。葡萄是喜光植物,对温室内光环境具有较高的要求。补光是改善设施内的光照环境、提高设施葡萄品质以及产量的重要手段。但由于设施内光照时间短,严重影响了葡萄的正常生长发育和果实的质量。因此,采用适当的补光方法,弥补光照不足带来的不利影响,对促进设施内葡萄的生长和提高果实品质具有重要意义。本试验以发光二极管(LED)作为补光光源,以‘秋黑’和‘阳光玫瑰’葡萄为试材,研究了不同光谱的补光灯(一号灯红蓝比=2:1,二号灯红蓝比=3:1,三号灯红蓝比=6:1)对设施葡萄植株生长及果实品质的影响;以优系‘HGN’和‘夕Bioactive hydrogel阳红’葡萄为试材,探索葡萄果实离体照射的适宜光质以及适宜温度。主要试验结果如下:日光温室进行LED补光,能够促进葡萄植株新梢的生长,三号灯处理的茎粗(8月12日为12.20 mm)在各处理中值最高且显著高于其他补光处理。LED补光有助于葡萄叶片形态及叶片生理指标的提升,在两个品种葡萄中,一号灯处理叶片颜色更黑。二号灯处理的叶片色泽偏绿。相较于其他处理,三号灯处理能够有效提高‘秋黑’葡萄的叶绿素含量(24.79SPAD)、叶片厚度(0.34mm)、叶片横径(24.88cm)和叶柄长(14.83cm),有利于植株进行水分积累及新陈代谢。对‘秋黑’及‘阳光玫瑰’葡萄生长期进行LED补光,均加强了叶片光合能力和叶绿素荧光效率。一号灯处理的净光合速率和气孔导度值最高且显著高于对照,三号灯处理的胞间CO_2浓度值最低。相比于对照,各补光处理的初始荧光,非光化学猝灭系数均下降了,而最大荧光、最大光能转换效率、光合量子产额、表观电子传递速率均得到了增加,其中一号灯处理的最大光能转换效率值最高且显著高于各处理。各补光处理均提高了葡萄根系活力和叶片代谢能力,在根系活点击此处力指标中,三号灯处理的值(74.65μg TTC g~(-1)h~(-1))最高且显著高于各处理。一号灯和二号灯处理均较对照显著下降了MDA含量,一号灯处理的‘阳光玫瑰’葡萄的SOD酶活性显著高于对照。此外,三号灯处理的POD酶活性显著高于各补光处理。在可溶性糖指标中,一号灯处理值最高并且显著高于对照处理,而三号灯处理的可溶性淀粉和可溶性蛋白均显著高于对照。一号灯处理在提高叶片代谢能力方面优于其他处理。补光处理后,一号灯处理的果皮颜色更深,三号灯处理的单果重、单粒横径值最大且显著高于对照处理。在内在品质指标中,补光处理均增加了浆果的可溶性固形物含量和维生素C含量,其中三号灯处理的值最高并且显著高于对照。三号灯处理更有利于提高‘秋黑’葡萄的果实品质。采后不同温光处理能够有效提高葡萄果皮色泽及内在品质。各光照处理均较对照增加了可溶性固形物含量;果实色泽与温度成正相关,UV-A和UV-B处理均改善了葡萄果实的色泽,其中UV-B效果更为显著,综合考虑果实色泽效果及果实品质,20℃UV-B处理效果最佳。

本研究在大麦表面分离筛选出30株微生物，并在浸麦阶段添加，进行反侵染小型制麦实验，其中反侵染B26菌株的麦芽，其麦汁浊度出现明显增加，由0.6±0.1 EBC最大上升至7.7±0.2 EBC，可使麦汁浊度升高11倍多，结合其形态特征和生理生化特性及16S rDNA基因测序分析比对，确定其属于阿氏肠杆菌（Enterobacter asburiae）。在糖化过程中，将β-葡聚糖酶、中性蛋白PD-0332991小鼠酶、脂肪酶按不同比例添加到阿氏肠杆菌反侵染麦芽中，结果显示，脂肪酶可有效降低反侵染麦芽麦汁浊度，分别按每克麦芽添加0.002%和0.01%脂肪酶，可将麦汁浊度由7.7±0.2 EBC分别下降至4.1±0.1和2.9±0.1 EBC。通过液相分析对比阿氏肠杆菌反侵染麦芽与Zemstvo medicine对照组的脂肪酸情况，C18∶1、C18∶2、C18∶3含量分别增加117%、113%、59%，添E-616452体外加脂肪酶后，C18∶1、C18∶2、C18∶3含量分别减少37%、38%、22%，确定阿氏肠杆菌反侵染麦芽中的致浊物质主要是C18∶1、C18∶2、C18∶3。

Dinaciclib分子式小麦是重要的粮食作物之一,在保障粮食安全中发挥着重要作用。随着全球人口日益增长,小麦的总产量与对小麦的需求量间仍存在较大的差距。提高小麦单产是解决这些问题的重要途径之一。千粒重作为产量三要素之一,是典型的数量性状,由多个基因调控,在产量提高中具有正向作用。有关粒重的研究主要包括QTL定位、粒重基因克隆、粒重形成机理等方面。对于具有复杂基因组的六倍体小麦来说,通过QTL定位挖掘候选基因的难度较大,而直接用反向遗传学进行研究范围比较盲目。因而综合利用正反向遗传学方法,对于小麦粒重候选基因挖掘更为实用。本研究从剩余杂合系RHL81自交后代中选取一对在籽粒发育过程中粒重均有显著差异的材料(RHL81-L和RHL81-S)进行BSR分析、转录组分析。利用RHL81-3自交产生的含136个单株的HIF81群体进行QTL定位。以294个水稻粒重基因为输入序列,使用Blast P方法,寻找与水稻粒重基因同源的小麦基因。综合分析以上三种方法的结果后,最终筛选到4个核心候选基因。从中挑选2个基因进行功能标记开发与优异单倍型分析。与此同时,考虑到小麦TaGW2基因在小麦粒重调控中的重要作用,应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对国审品种西农529进行改良,创制小麦TaGW2基因突变体材料。总的来说,本研究为小麦分子标记辅助选择育种奠定了基础,也为后续小麦优质高产新种质材料创制提供了遗传材料。主要结果如下:(1)通过对RHL81-L、RHL81-S和HIF81群体的表型分析,明确了粒重的差异与粒长、灌浆速率、灌浆时间的差异有关。在5DL、7AS上共鉴定到4个粒重QTL:QTGW.nwafu.hif81-5D.1、QTGW.nwafu.hif81-5DL.2、QTGW.nwafu.hif81-7A.1和QTGW.nwafu.hif81-7A.2。QTL区段内有512个高可信度基因。(2)通过对RHL81-L和RHL81-S在4、7、10 DPA的籽粒进行转录组测序,在RHL81-L、RHL81-S籽粒发育中分别鉴定到12908、18035个差异表达基因。RHL81-L和RHL81-S间共鉴定到16048个差异表达基因,其中5244个为核心差异表达基因。(3)综合QTL定位、转录组分析、同源序列分析结果,初步确定247个候选基因,最Prebiotic activity终预测了4个核心候选基因。其中Traes CS5D02G553000(Ta CWI50)位于5DL粒重QTL区段内,与已www.selleck.cn/products/stm2457报道粒重相关基因Ta CWI-5D(Traes CS5D02G552900)同源且相邻分布,Traes CS7A02G009100、Traes CS7A02G009200和Traes CS7A02G009500(Ta VI27)在QTL定位、转录组分析和同源序列分析中均被鉴定到。(4)对Ta VI27和Ta CWI50这两个候选基因进行功能标记开发,关联分析结果表明Ta VI27-Hap1和Ta CWI50-Hap2分别为两个基因的优异单倍型,且两个基因的优异单倍型均与较高的基因表达相关。在育种过程中,Ta CWI50-Hap2经历了正向选择,而Ta VI27-Hap1在育种中未被正向选择,具有很大的育种潜力。(5)本研究用国审品种西农529作为受体改良材料,应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得了TaGW2基因突变植株。获得2个以西农529为背景,粒宽和穗长均显著增加而其他农艺性状未发生变化的突变株系(T-31-1-3和T-31-2-7)。这些突变体材料为小麦高产育种提供遗传材料。

目的:基于铁死亡探讨白藜芦醇对脓毒症心肌病(sepsis-induced cardiomyopathy,SIC)所致心肌损伤的作用机制。方法:通过盲肠结扎穿孔手术(CLP)制备大鼠SIC模型,将80只SPF级SD雄性大鼠按照不同处理分成以下组别:假手术(Sham)组,脓毒症模型(CLP)组,白藜芦醇低、中、高剂量白藜芦醇(L、M、H-RSV)组,铁死亡抑制剂(Fer-1)组,Sirt1抑制剂(EX527)组。各组大鼠造模24h后进行取材检测,通过心肌酶检测观察心肌损确认细节伤程度、心脏超声观察心功能障碍、HE病理学染色观察心肌组织形态学变化、细胞实验及透射电子显微镜观察线粒体损伤程度、免疫印迹法检测铁死亡相关蛋白GPX4、ACSL-4、TFR、FTH-1和关键调节蛋白Sirt1、Nrf2,免疫组化染色观察调节蛋白Nrf2表达情况,比色试剂盒检测Fe~(2+)、MDA、GSH含量,免疫荧光染色观察4-HNE变化评价脂质氧化程度。结果:(1)与Sham组相比,CLP组心肌酶明显上升,超声心动图显示左室射血分数下降,HE染色发现心肌细胞肿胀,炎症细胞浸润,在使用白藜芦醇后,发现它能以剂量依赖性的方式改善上述参数,同时使用铁死亡抑制剂也显示出保护作用。(2)透射电子显微镜观察到大鼠心肌细胞线粒体膜结构缺失、线粒体嵴模糊甚至消失,高剂量的白藜芦醇可以减轻线粒体损伤,H9C2心肌细胞实验进一步表明白藜芦醇可以减少ROS、降低线粒体膜电位,减轻LPS诱导的脓毒症改变。(3)观察大鼠心肌组织的铁死亡情况,发现相较于脓毒症模型组,高剂量白藜芦醇组中大鼠心肌组织铁死亡关键蛋白GPX4、FTH-1表达上调,ACSL-4、TFR表达下调,同时Fe~(2+)、GSH含量、MDA含量及4-HNE含量降低,说明高剂量白藜芦醇可以减轻铁死亡。(4)使用Sirt1抑制剂进一步明确白藜芦醇的作用机制,发现Sirt1可以增加Surgical antibiotic prophylaxisNrf2BMS-907351体内实验剂量表达,上调ACSL-4、TFR表达,下调GPX4、TFR表达,大鼠心肌组织中Fe~(2+)、GSH、MDA及4-HNE含量上升,加重了铁死亡。结论:本研究证实白藜芦醇可通过激活SIRT1/Nrf2信号通路调控铁代谢和脂质氧化,减少ROS产生和减轻线粒体损伤继而抑制铁死亡,从而改善了SIC所致的心功能障碍。

研究背景与目的肝癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤,病死率高,极大地威胁着人类的生命健康。而中国是世界上乙肝病毒携带者最多的国家,因此成为原发性肝癌患者最多的国家,肝癌患者数约占每selleck NMR年全球新发肝癌患者的50%,其死亡率也位居全球第三位。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)具有起病隐匿、进展快、复发早、易耐药和预后差的临床特点。HCC的治疗以放疗、化疗、介入、微创和靶向药物等综合治疗为主,其中靶向治疗药物索拉菲尼因快速耐药的产生严重影响疗效。而一线化疗药物的疗效也因多药耐药的产生而受到严重的影响。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是临床常用的HCC化疗药物之一,可以有效的杀灭或抑制肝癌细胞的生长,但其长期应用可诱导癌细胞产生耐药性,导致其治疗效果不佳。与正常组织相比,癌细胞存在大量的代谢异常,且不同肿瘤之间、不同癌症的发展阶段都存在代biomimetic transformation谢特异性,尤其是癌症进展后期因治疗耐药性会出现新的代谢表型依赖性。针对于癌细胞耐药后出现的适应性代谢特点,我们拟研究代谢重编程与5-FU耐药的肝癌细胞之间的相关性。谷氨酰胺作为机体中含量最丰富的氨基酸,在生物体内参与多个代谢途径,包括三羧酸循环、核苷酸生物合成途径、非必需氨基酸合成途径、维持氧化还原平衡状态等。与正常组织相比,癌细胞消耗谷氨酰胺的速率超过谷氨酰胺生物合成的速率。因此,谷氨酰胺的代谢重编程在肿瘤的恶性进展中发挥重要的作用。谷氨酰胺酶(Glutaminase,GLS)作为谷氨酰胺代谢途径中限速酶,可将谷氨酰胺转化为谷氨酸,后者转化成α-酮戊二酸参与调控其他代谢通路。根据TCGA数据库显示,与正常组织相比,GLS通常在肿瘤组织中具有更高的表达水平和活性,例如胃腺癌、肝细胞癌和结肠腺癌等。基于癌症特征分析工具显示,GLS在癌症中的功能与细胞能量学、氧化还原稳态、维持增殖信号传导、诱导凋亡、驱动肿瘤进展、侵袭和转移以及不良预后相关。为了解决肝癌细胞因耐药导致患者治疗效果不佳的问题,本研究分析了耐药肝癌细胞的代谢特点,从肿瘤代谢重编程出发解决常规化疗药物5-FU应用于临床肝癌患者后出现耐药性的问题,以期提高抗肿瘤药物的化疗效果,为促进临床合理用药提供实验依据和理论支持。实验方法和结果1.MTT法检测Bel7402/5FUCL13900纯度细胞的耐药性以及耐药倍数,实验结果显示5-FU作用于细胞48 h和72 h后耐药倍数分别为98.14倍和66.08倍。2.MTT法和克隆形成实验检测Bel7402细胞和Bel7402/5FU细胞对谷氨酰胺依赖性差异,结果发现耐药后细胞对谷氨酰胺依赖性显著增加。3.使用还原性谷胱甘肽(Glutathion,GSH)含量检测试剂盒检测Bel7402和Bel7402/5FU细胞中的GSH水平,实验结果显示与Bel7402细胞相比,Bel7402/5FU细胞中GSH水平明显上升,在缺乏谷氨酰胺条件下Bel7402/5FU细胞的GSH水平下降。4.使用DCFH-DA染色法检测Bel7402细胞和Bel7402/5FU细胞中ROS水平,发现耐药细胞的ROS水平升高,在缺乏谷氨酰胺条件下Bel7402/5FU细胞的ROS水平进一步上升。5.探究Bel7402细胞耐药后支持氧化还原水平发生变化的因素,实验结果显示Bel7402/5FU细胞中G6PD蛋白表达水平下降,说明产生的NADPH磷酸戊糖途径减弱,这导致了细胞耐药后氧化还原水平发生变化。6.TCGA数据库分析GLS在癌症中的功能以及与肿瘤预后的相关性,发现GLS高表达与不良预后相关。7.使用GLS活性检测试剂盒检测Bel7402细胞和Bel7402/5FU细胞中GLS活性差异,实验结果显示Bel7402/5FU细胞中GLS活性明显高于Bel7402细胞。8.MTT法检测谷氨酰胺酶抑制剂CB-839对Bel7402细胞和Bel7402/5FU细胞的抗增殖作用,结果发现CB-839对Bel7402/5FU细胞的抗增殖作用更强。9.使用Gln检测试剂盒检测使用GLS抑制剂CB-839后细胞内谷氨酸水平的变化,实验结果显示使用CB-839显著降低了 Bel7402/5FU细胞内谷氨酸水平,说明GLS活性受到了抑制。10.MTT法检测GLS抑制剂CB-839和5-FU联合应用对Bel7402/5FU细胞产生的抗增殖效果,结果显示二者存在协同抗增殖作用。11.细胞划痕实验、Transwell实验检测CB-839和5-FU联合应用对Bel7402/5FU细胞侵袭、迁移能力的影响,实验结果证明二者联用能够抑制Bel7402/5FU细胞侵袭、迁移能力,并且抑制侵袭、迁移相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达。12.使用流式细胞仪检测CB-839和5-FU联合应用对Bel7402/5FU细胞周期分布的影响;实验结果显示二者联合应用使Bel7402/5FU细胞周期阻滞在S期和G2期并影响周期相关蛋白CDK1、Cyclin B1和Cyclin A2的表达。13.Western blot实验检测CB-839和5-FU联合应用是否影响PI3K/Akt/mTOR信号通路,实验结果显示二者联合应用后PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达降低。14.采用吖啶橙染色实验、Annexin V-FITC/PI双染实验以及Hoechst 33342染色实验检测CB-839和5-FU联合应用对Bel7402/5FU细胞凋亡和自噬的影响,实验结果证明二者联合应用对Bel7402/5FU细胞凋亡和自噬无明显影响。15.采用GSH检测试剂盒检测Bel7402/5FU细胞在使用5-FU和CB-839后GSH水平,实验结果证明单用5-FU使细胞内GSH水平上升以应对5-FU造成的ROS水平升高,单用CB-839由于抑制了谷氨酰胺代谢,使GSH的水平减少,二者合用抑制了 5-FU造成的GSH水平的升高,从而促进了 5-FU对细胞造成的氧化应激。16.使用DCFH-DA染色法检测CB-839和5-FU联合应用对Bel7402/5FU细胞中ROS水平的影响,实验结果显示使用5-FU或CB-839后细胞中ROS水平有不同程度的上升,二者合用后细胞中的ROS水平进一步显著上升。17.使用铁离子检测试剂盒和MDA检测试剂盒检测CB-839和5-FU联合应用对Bel7402/5FU细胞中铁离子和MDA水平的影响以及Nrf2-HO-1-GPX4通路蛋白水平的变化。实验结果显示二者联用后,Bel7402/5FU细胞中铁离子水平和MDA水平明显升高,并且Nrf2-HO-1-GPX4通路的蛋白水平下降,证明其死亡方式与铁死亡相关。18.采用动物体内实验检测CB-839联合5-FU对裸鼠Bel7402/5FU移植瘤的生长抑制作用。实验结果显示CB-839和5-FU合用可以显著抑制移植瘤的生长。另外,除合用组外,其他三组裸鼠出现不同程度的肝转移。这提示我们CB-839和5-FU联合应用在一定程度上可以抑制肝癌的转移。Western blot实验检测各组铁死亡相关蛋白GPX4和HO-1的表达变化,采用免疫组化检测GPX4的表达。实验结果发现合用组GPX4和HO-1的表达显著下降。以上实验结果说明CB-839和5-FU联合应用通过促进癌细胞铁死亡有效抑制肿瘤的发生发展。实验结论论文研究发现,肝癌细胞Bel7402/5FU的谷氨酰胺代谢依赖性发生改变,对谷氨酰胺的依赖性显著增强;Bel7402/5FU细胞内谷氨酰胺酶过度活化,谷胱甘肽合成增多,细胞内ROS水平也升高。利用GLS抑制剂CB-839与5-FU联合应用可以协同抑制细胞的增殖、侵袭、迁移并造成周期阻滞,但并不诱导细胞凋亡和自噬。另外,二者合用能够破坏Bel7402/5FU细胞氧化还原稳态,降低细胞内谷胱甘肽水平使其ROS水平上升,造成细胞内氧化应激,同时Fe2+水平和MDA水平上升,诱导细胞发生铁死亡,从而抑制癌症的恶性进展。研究意义本论文探究了肝癌细胞Bel7402在发生耐药后,细胞内发生了谷氨酰胺代谢重编程和ROS水平变化。因此,GLS抑制剂对Bel7402/5FU细胞有较强的杀伤性和靶向性,与5-FU联合应用在体外具有较好的抗增殖、侵袭、迁移和促进细胞铁死亡的作用。本论文旨在从耐药细胞的新的适应性代谢特点出发,提出特异性靶向耐药癌细胞的有效的治疗手段,从而为临床耐药患者提供更好的治疗方案和新的治疗思路。