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背景:脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是严重的中枢神经系统(central nervous system,CNS)创伤性疾病~([1])。中国SCI的年发病率约为37/100万,给个人和社会带来了沉重的医疗和经济负担~([2])。然而遗憾的是,由于SCI病理机制的复杂性和CNS神经元的不可再生性,SCI的临床治疗缺乏理想的方法。因此,探寻创新有效的 SCI治疗方案仍然是神经科学的重大任务,需要对SCI的病理机制进行深入研究。神经元死亡是SCI后神经功能障碍的直接原因,除了原发性损伤之外,炎症反应、缺血缺氧等也是影响神经元存活的继发性因素~([1])。铁死亡是一种程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD),以铁离子过载和活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的积聚诱导细胞发生脂质过氧化为主要特征~([3])。细胞铁死亡参与多种疾病。根据现有研究提示,SCI后组织大量出血、溶血导致损伤局部出现铁离子超载,诱发神经细胞发生铁死亡;同时应激反应激活大量ROS的产生,使用铁死亡抑制剂去铁胺等可抑制铁死亡,从而促进SCI后功能恢复~([4])。小胶质细胞介导的促炎性反应参与脊髓继发性损伤,其中损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)与Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)结合~([5]),启动TLRs/髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,My D88)信号级联。铁死亡发生常常伴随小胶质细胞的促炎性激活,然而小胶质细胞在SCI后神经元铁死亡过程中发挥的作用及其分子机制尚不清楚。因此,探索小胶质细胞My D88信Indirect immunofluorescence号对SCI后神经元铁死亡的调控作用及其可能的分子机制,可更好地认识SCI继发性损伤机制,并可为新的SCI治疗策略LGK-974分子式和靶点提供研究依据。研究目的:本研究旨在通过小鼠SCI模型和细胞培养实验的研究,阐明小胶质细胞My D88信号对神经元铁死亡发生发展中的调控作用及分子机制,以探寻挽救SCI过程中神经元铁死亡的新靶点。1、建立小鼠SCI模型探讨SCI后神经元铁死亡与小胶质细胞促炎性激活之间的关系。2、通过体内外实验探索促炎性激活的小胶质细胞在神经元铁死亡中发挥的作用与调控机制。研究方法:1、使用小鼠脊髓夹伤模型作为SCI的在体研究模型,使用神经元细胞系SH-SY5Y和小鼠原代神经元氧糖剥夺/复氧模型(oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)作为离体实验研究模型。2、BMS(Basso Mouse Scale)评分和步态分析评估小鼠SCI后运动功能恢复情况。3、苏木精伊红染色(hematoxylin eosin,HE)检测小鼠SCI后损伤中心空洞大小。4、通过测定组织铁浓度和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量反映脊髓组织铁积累和抗氧化水平。5、通过蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)及免疫荧光染色实验观察组织和细胞各相关蛋白分子的表达改变情况。6、通过共培养小胶质细胞和神经元细胞观察两者间的互作关系。7、碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色结合流式细胞术观察神经元细胞死亡率。8、CCK8(Cell Counting Kit-8)法检测神经元细胞活力改变情况。9、通过丙二醛(malondialdehyde,MDA)、4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4HNE)水平检测神经元内脂质过氧化情况。10、通过BODIPY C11 581/591荧光探针检测神经元内Lipid ROS产生情况。11、用透射电镜观察脊髓神经元细胞内线粒体形态。12、通过荧光探针JC-1检测神经元细胞内线粒体膜电位改变情况。13、引入My D88~(f/f);TMEM119-Cre/ERT转基因小鼠,观察特异性敲除小胶质细胞My D88对SCI后神经元铁死亡的影响。14、用荧光原位分子杂交显示条件敲除小鼠脊髓的My D88 m RNA分布。研究结果:第一部分神经元铁死亡和小胶质细胞My D88信号激活同时出现于脊髓损伤区域用野生型(wild type,WT)小鼠建立SCI模型后,检测组织铁浓度及还原型GSH水平,发现SCI后三天组织铁含量显著升高,还原型GSH明显下降。此外,免疫荧光染色结果显示邻近损伤中心的神经元长链脂酰辅酶A合成酶4(acyl-Co A synthetase long-chain family member 4,ACSL4)表达显示增多。通过SCI小鼠的脊髓免疫荧光染色,我们发现发生脂质过氧化的神经元旁有明显活化的小胶质细胞。Western Blot结果显示,SCI后铁死亡信号激活,同时My D88/NF-κB信号通路显著激活。第二部分促炎性激活的小胶质细胞My D88上调促进神经元铁死亡CCK8法检测细胞活力结果显示,OGD/R处理使SH-SY5Y细胞活力降低;而使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的小胶质细胞条件培养基(conditional medium,CM)可以在OGD/R基础MS-275细胞培养上进一步显著降低SH-SY5Y细胞活力。PI染色后进行流式分析结果同样表明,在OGD/R处理的基础上,LPS刺激过的小胶质细胞CM可以进一步提高SH-SY5Y细胞死亡率。相一致的,Western Blot检测表明,CM培养的SH-SY5Y细胞中铁死亡分子谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase4,GPX4)的蛋白水平显著下降。另外,被LPS刺激后,促炎性激活的小胶质细胞My D88、NF-κB p65、i NOS表达显著升高;而在My D88抑制剂ST2825作用下,LPS刺激的小胶质细胞促炎性激活被显著抑制,而且这种小胶质细胞的CM不会进一步加剧OGD/R的SH-SY5Y细胞活力下降和死亡率升高。相似的,用Transwell将OGD/R处理的神经元与LPS处理的小胶质细胞共培养后,神经元细胞活力进一步下降,死亡率进一步升高。ST2825可以明显抑制小胶质细胞因LPS刺激而升高的My D88/NF-κB表达及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)和细胞因子IL-1β的表达;将其与OGD/R处理的神经元共培养后,神经元细胞活力下降和死亡率升高的现象有所改善。细胞免疫荧光染色显示,共培养的神经元细胞Lipid ROS的表达显著降低,提示神经元脂质过氧化被抑制。检测神经元的丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量进一步证明,小胶质细胞My D88信号上调促进共培养的神经元脂质过氧化。Western Blot证明,抑制小胶质细胞My D88表达后,共培养的神经元铁死亡信号被明显抑制。荧光染色检测神经元线粒体膜电位JC-1证明促炎性活化的小胶质细胞进一步损伤神经元线粒体。第三部分小胶质细胞特异性My D88缺失抑制SCI后神经元铁死亡,并促进运动功能恢复他莫昔芬灌胃诱导TMEM119-Cre ERT;My D88~(flox/flox)转基因小鼠小胶质细胞中My D88的特异性敲除(My D88 CKO),通过荧光原位分子杂交和Western Blot证明特异性敲除小胶质细胞My D88的转基因小鼠构建成功。用该小鼠建立SCI模型比对照小鼠更早出现后肢站立、运动功能恢复更快且更好;HE染色也证明My D88 CKO小鼠SCI后脊髓组织损伤空洞较My D88 f/f小鼠的空洞更小。透射电镜结果证明,My D88 CKO小鼠SCI急性期损伤周边神经元异常线粒体较少,线粒体缩小程度下降。组织Western Blot检测进一步证实,My D88 CKO SCI小鼠SCI较同窝对照组脊髓My D88/NF-κB通路明显抑制,同时铁死亡信号通路同样明显减弱,损伤中心附近神经元脂质过氧化减轻,与还原型GSH的检测结果也相一致。第四部分小胶质细胞My D88信号参与脊髓损伤后神经元铁死亡的潜在机制在小胶质细胞与OGD/R处理的神经元共培养体系中,Western Blot与细胞免疫荧光染色表明,LPS刺激使小胶质细胞中的铁调素(hepcidin)表达升高,而与LPS激活的小胶质细胞共培养的神经元铁转出蛋白(ferroportin,FPN)表达在OGD/R基础上显著下降,转铁蛋白受体(transferrin receptor,Tf R)显著升高。但是当小胶质细胞My D88受到抑制时,hepcidin的表达也显著下降,同时,神经元下降的FPN和升高的Tf R也被逆转。脊髓组织Western Blot结果同样显示,SCI后My D88 f/f组和My D88 CKO组hepcidin都明显上调,然而,与My D88 f/f SCI组相比,My D88 CKO SCI组脊髓hepcidin表达受到明显抑制。相应的,在My D88 f/f小鼠中,SCI后表现为FPN的下降和Tf R的升高。但在My D88 CKO SCI小鼠中,与My D88 f/f小鼠相比,FPN的和Tf R的改变同样被显著逆转。结论:SCI急性期神经元发生铁死亡,伴随邻近的小胶质细胞活化和My D88信号通路激活的结果提示SCI引起的小胶质细胞活化与神经元铁死亡之间的密切关系。细胞培养实验证明了小胶质细胞促炎性活化能促进神经元在OGD/R基础上进一步发生铁死亡。抑制小胶质细胞My D88表达可以明显抑制神经元铁死亡发生,证明小胶质细胞介导的My D88信号在神经元铁死亡中发挥关键作用。TMEM119-Cre ERT;My D88~(flox/flox)转基因小鼠特异性敲除小胶质细胞My D88能够显著下调SCI急性期神经元铁死亡基因,明显促进SCI后运动功能恢复,从而用在体实验证明了小胶质细胞My D88信号的上调在SCI后促进脊髓神经元铁死亡,而下调小胶质细胞My D88信号可减轻神经元铁死亡。小胶质细胞My D88信号与神经元铁死亡的互作主要由IL-1β/hepcidin/FPN轴调控。本研究为SCI中神经元铁死亡的调控机制提供了新的认识,可望为未来治疗SCI提供新的思路和靶点。

番茄(Solanum lycopersicum)是我国栽培面积较大的蔬菜之一,其侧枝是一个重要的农艺性状,直接决定植物的形态结构。过多的侧枝往往会争夺营养分配和采光,降低土地利用率,并对作物果实的数量、产量以及品质产生不良影响,还易引起各种病害。在番茄的栽培生产过程中,由于番茄的分枝能力较强,侧枝生长旺盛,无论利用传统栽培管理还是智能机械化管理,都要定期对番茄的侧枝进行管理,整枝打杈已经成为番茄栽培中最耗时耗力的管理环节。选育少侧枝番茄品种是解决问题的重要途径之一,然而,目前在番茄的种质资源库中暂未发现少侧枝或者无侧枝的品种。前人研究发现,黄瓜Cs PIN3(PIN-FORMED3)基因、苹果Md WUS(WUSCHEL)基因和番茄Sl Sde1A(Super determinant1A)基因功能缺失引起的突变可以抑制黄瓜、苹果以及番茄侧枝的生长。基于这些发现,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将番茄中的Sl PIN4、Sl WUS、Sl Sde1A基因进行敲除,以期获得少侧枝的番茄种质资源。本研究主要获得了以下研究结果:1.敲animal biodiversity除Sl PIN4、Sl Sde1A两个基因对番茄侧枝的生长有抑制作用,而敲除番茄Sl WUS基因后,对侧枝的生长没有抑制作用。2.获得的番茄T_0代、T_1代slpin4和slsde1a突变体,侧枝数量相较于野生型(VE-822 IC50WT)植株数量均Entinostat分子量减少,获得了少侧枝的番茄种质材料,达到了预期效果。获得的番茄slwus突变体T_0代侧枝数量未发生变化,但节间变短、植株矮小,开花后花柱扁平且无花粉。3.通过对番茄slpin4突变体T_1代进行检测并测序,获得1株未携带Cas9蛋白的番茄株系,且该株系侧枝数量相较于野生型数量减少,即为非转基因的基因编辑番茄种质材料。

磺胺甲恶唑(SMX)作为一种广谱性抗生素,广泛应用于Liver biomarkers诸多感染性疾病的治疗中,但因其潜在的生态威胁,已经受到政府和环境领域研究人员Apoptosis抑制剂的广泛关注。目前抗生素处理工艺多选择高能耗或可能产生二次污染的物理化学去除方法。近期研究发现,微生物在好氧情况下,可以产生胞外活性氧(ROS),Antineoplastic and I抑制剂实现对难降解有机污染物的高效去除,但关于该过程对SMX的降解性能以及微生物作用下活性氧产生及防御机制仍不清晰。本研究设计了一种希瓦氏菌(Shewanella Oneidensis MR-1)介导的类芬顿反应,用于自催化生成胞外活性氧,以降解磺胺甲恶唑。研究发现该体系在菌浓为109 cell/mL的情况下,最大降解速度达到38.3μM/L,在48h内高效降解SMX,且可以在15个周期内高效运行。根据量子化学计算及LC-MS/MS测试结果推测了 SMX三种可能的降解路径:去苯氨基作用、S-N键断裂及乙酰化作用。其中去苯氨基作用和S-N键断裂作用位点与羟基自由基攻击的活性位点相同,是自由基攻击的结果;而乙酰化作用中反应开始于异恶唑环的裂解,可能是S.O.MR-1菌株生物降解SMX的结果。ECOSAR毒性分析结果表示,降解过程中的多数中间产物毒性相比于磺胺甲恶唑毒性显著降低,但仍需注意过程中苯系物的生成。基因组注释结果显示,希瓦氏菌中存在大量产活性氧相关基因及抗氧化应激基因。转录组测序结果显示,产活性氧的相关基因中,编码L-氨基酸氧化酶的nadB基因表达在生物类芬顿组中显著上调,编码NADH氧化还原的酶(nqr1、nuo和nqr2)也在生物类芬顿组和无Fe(Ⅲ)对照组中普遍表达,表明希瓦氏菌产生胞外活性氧是NADH氧化还原酶与L-氨基酸氧化酶共同作用的结果。KEGG富集分析结果表示,S.O.MR-1首先通过分泌胞外多聚物作为第一道防线,保护细胞膜免受活性氧的氧化作用;同时利用酶性抗氧化剂(超氧化物歧化酶和过氧化氢酶)及非酶抗氧化剂(谷胱甘肽和γ-氨基丁酸)共同抵御氧化应激。胞外高活性氧浓度使得S.O.MR-1同时启动了活性氧抗性机制。本研究探索了希瓦氏菌介导的类芬顿反应对SMX的降解性能,分析了胞外活性氧产生及抗氧化应激机制,为难降解有机污染物的微生物强化降解工艺开发提供了技术支持与理论依据。

高香型茶树品种一直深受育种工作者和种植生产者关注,其产品深受消费者青睐。‘春闺’是‘黄旦’自然杂交而成的高香型茶树新品种,其制成的乌龙茶滋味醇爽,具有类似茉莉花的特殊香气。目前关于春闺乌龙茶的研究集中在生化成分或低通量香气检测方面,高通量代谢组结合分子层面解析春闺乌龙茶加工过程中的风味品质形成机制的研究鲜有报道。本研究以春闺乌龙茶加工过程样为材料,利用代谢组学技术系统分析春闺乌龙茶加工过程中代谢物的动态变化,结合转录组学构建了春闺乌龙茶加工中滋味、香气与基因之间的共表达网络,挖掘出风味品质相关的关键调控基因,探讨春闺特征风味物质在加工过程中的形成和转录调控,为春闺乌龙茶加工工艺优化和新品种推广研究提供参考。主要结果如下:1.春闺乌龙茶加工过程中滋味物质动态变化研究利用广泛靶向代谢组学技术从春闺闽北乌龙茶加工过程样中检测出31个类别共1060个代谢物,其中黄酮类、酚酸类、氨基酸及其衍生物和脂质是最主要的代谢物类型。结合多元统计分析和倍数差异分析,从春闺乌龙茶加工过程中筛选出660个差异代谢物。功能富集分析表明与茶叶滋味品质形成相关的氨基酸生物合成、类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、苯丙烷生物合成通路被多次显著富集。差异代谢物动态变化分析表明,在春闺乌龙茶加工过程中,氨基酸含量总体呈上升趋势,L-组氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、L-赖氨酸、L-亮氨酸等氨基酸含量在做青阶段显著增加并达到峰值。柚皮素、圣草酚、芹菜素等类黄酮物质在春闺乌龙茶加工中含量升高,EC、C、EGC、GC、EGCG等儿茶素单体含量降低。有机酸、脂质此网站、核苷酸和茶黄素类物质在加工中含量显著增加。水杨酸、丁香酸等酚酸类和D-蔗糖、木糖醇等糖类物质含量在干燥工序达到峰值。2.春闺乌龙茶加工过程中香气物质动态变化研究采用挥发性代谢组学技术对春闺闽北乌龙茶加工过程中的香气物质进行测定,共鉴定出10个类别的220个香气物质,以醇类、酯类、烯烃类为主。香气总含量在做青结束后达到最高水平。从加工过程样中筛选出的25个关键香气物质呈现出3种变化趋势:具有花果香的橙花叔醇、吲哚、香叶醇等物质含量在乌龙茶萎凋或做青阶段达到峰值;具有青草气的乙酸叶醇酯、3-己烯-1-醇等物质含量随加工工序呈下降趋势;苯甲醇、苯乙醇、γ-己内酯等物质含量在加工过程中波动上升,干燥后达到峰值。根据相对气味活性值(ROAV)和香气特征影响值(ACI)筛选出芳樟醇、香叶醇、吲哚、茉莉酮、γ-己内酯和α-法呢烯作为构成春闺乌龙茶“品种香”的关键香气物质。其中具有茉莉花香的吲哚(ROAV=186.54,ACI=3.07%)和茉莉酮(ROAV=142.83,ACI=2.35%)是赋予春闺乌龙茶特殊茉莉花香的关键成分,萎凋和做青是促进二者含量积累的关键工序。3.春闺乌龙茶加工过程中差异基因表达模式分析对春闺闽北乌龙茶加工中酶促氧化阶段样品进行转录组测序,鉴定出17256个差异表达基因。GO注释表明大量差异基因注释到代hepatocyte size谢和刺激响应的生物过程,以及催化活性、结合等分子功能条目。KEGG富集分析表明差异基因主要富集在苯丙烷生物合成、类黄酮生物合成,以及与香气合成直接相关的萜类合成途径。转录因子分析结果显示MYB、ERF、WRKY、b HLH、NAC等转录因子家族对春闺乌龙茶加工过程中风味物质形成具有潜在的调控作用。春闺与黄旦品种鲜叶转录组数据比较结果表明,与吲哚和萜类香气形成相关的ASA1、PAT1、TSB2和DXS、DXR、NES、TPS等关键基因在春闺中的表达量显著高于黄旦。与类黄酮等滋味物质形成相关的ANR、ANS、LAR、DFR、FLS、C4H、CHI、CHS、F3H、F3’H等基因表达量极显著低于黄旦。4.春闺乌龙茶加工中特征风味物质形成转录调控分析通路分析表明,类黄酮合成途径上游关键基因PAL和C4H在春闺乌龙茶做青中后期显著上调,调控L-苯丙氨酸和肉桂酸含量在做青阶段达到峰值。编码黄酮醇和儿茶素生物合成的关键基因CHS、CHI、FLS、DFR、LAR、ANR在萎凋和做青中后期下调最为显著,引起儿茶素等类黄酮物质含量PLX4032体内降低。NES、LIS、GES等萜类香气合成关键基因在春闺萎凋后显著上调,相应的香气物质橙花叔醇、香叶醇同步增加。吲哚合成相关的色氨酸合成酶基因TSB1和TSB2在萎凋工序大量表达,做青后期显著降低,但仍维持极高的表达水平。茉莉酸信号转导途径基因(JAR、COI1、MYC2)在萎凋工序显著上调,在做青工序显著下调,其中MYC2转录因子与TSB1和TSB2具有相似的表达模式。利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)构建了春闺乌龙茶加工中滋味、香气与基因之间的共表达网络,筛选得到2个WRKY、3个MYB、3个ERF、3个NAC和ARF、DBB、GRAS、GRF、MYB＿related、SBP共17个转录因子以及5个结构基因GGPS、NES、TSB2、JMT、CHS,这些关键枢纽基因在萜类挥发物、吲哚、茉莉酮、类黄酮等风味物质的生物合成中具有潜在的调控作用,从而影响春闺乌龙茶鲜醇滋味和茉莉花香的特征风味形成。

目的：基于肿瘤蛋白53cancer precision medicine(tumor protein 53,p53)/溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member11,SLC7A11/xCT)/谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathioneperoxidase4,GPX4)通路探讨疏肝祛瘀解毒方（SGQYJDF）诱导铁死亡抑制裸鼠肝癌增殖。方法：通过将人肝癌细胞株SK-Hep-1注射Baricitinib作用于裸鼠右腋皮下，建立异种皮下移植瘤模型，成模后分为模型对照组、SGQYJDF低、中、高剂量组和SGQYJDF中剂量联合Sorafenib组，按分组连续灌胃14 d，期间观察裸鼠肿瘤体积；灌胃14 d后，测量肿瘤质量并计算生长抑制率，采用HE染色观察各组肿瘤组织病理学变化；比色法检测各组肿瘤组织内丙二醛（malonWnt-C59体内实验剂量dialdehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）和亚铁离子（ferrous ions,Fe2+）水平；免疫组织化学法（immunohistochemistry,IHC）检测各组肿瘤组织内增殖标志物（Kiel 67antigen,Ki-67）及GPX4表达；免疫荧光法（immunofluorescence,IF）检测肿瘤组织内p53和xCT的表达；Western blot法检测p53、xCT和GPX4的表达水平。结果：（1）在肿瘤增殖方面，通过观察裸鼠肿瘤体积及质量并计算生长抑制率，与模型对照组比较，SGQYJDF能够呈剂量相关性的降低肿瘤体积（P<0.01），抑制肿瘤质量增长（P<0.01），各组肿瘤组织均未见明显浸润，同时通过IHC观察计算肿瘤组织内Ki-67阳性细胞率可知，与模型对照组比较，SGQYJDF能够呈剂量相关性降低肿瘤组织Ki-67阳性细胞率（P<0.01），抑制其增殖能力；（2）在铁死亡生化指标方面，通过检测计算相对含量，与模型对照组比较，SGQYJDF能够呈剂量依赖性提高肿瘤组织内Fe2+含量和MDA含量，同时降低GSH的含量（P<0.01）;(3)在蛋白表达方面，通过IHC、IF与Western blot实验，与模型对照组比较，SGQYJDF能够呈剂量相关性地上调p53(P<0.05)的表达，同时抑制xCT(P<0.05)和GPX4(P<0.01)的表达。此外，在实验结果中，我们发现人体等效量的SGQYJDF与Sorafenib联用，其效应高于两倍人体等效量的SGQYJDF。结论：提示SGQYJDF可能通过上调裸鼠皮下移植瘤p53的表达、抑制xCT和GPX4的表达从而诱导其发生铁死亡，抑制其增殖。

蜡梅(Chimonanthus praecox(L.)Link)是中国特产的传统名贵观赏花木,花色丰富,有着悠久的栽培历史和花文化,具有极佳的观赏特性、文化价值和应用前景。以3个蜡梅品种(‘金颜帘卷’、‘美人醉’和‘笑靥’)的5个时期(蕾期、萌动期、初花期、盛花期和末花期)的中被片、内被片为研究对象,综合分析3个品种开花过程中花色表型数据、花瓣表皮细胞形态和生理生化特征的变化,及3个品种盛花期的差异,运用相关性分析与主成分分析,探究蜡梅品种花色变化的规律及花色变化与生理变化之间的关系,以期能为3个品种的花色改良、品种分类等提供参考依据。主要研究结果如下:(1)随着花色变化,3个品种的花色变化幅度不一致。‘金颜帘卷’的中被片、内被片相较于‘美人醉’、‘笑靥’花色变化幅度较小,且三者的内被片变化比中被片更加显著;‘金颜帘卷’的中被片、内被片由黄绿色转为黄色,除a*以外的色度值均减小;‘美人醉’的中被片、内被片由Ceralasertib体内带有红晕arbovirus infection的黄绿色转为黄色,内被片a*显著减小;‘笑靥’中被片由带有红晕的黄绿色转为黄色,b*不断减小;‘笑靥’内被片红色逐渐减淡,a*显著减小。(2)3个品种的花瓣表皮细胞形态均成扁平状,与花色变化无明显相关,但是不同时期细胞的大小、表皮纹路有一定的差别;蕾期到末花期,花衰老且花瓣表皮细胞水分流失,导致中部凹陷,细胞与细胞之间的边界更清晰;3个品种的花瓣表皮细胞均有蜡质乳突和覆盖物。(3)3个品种的中被片、内被片均有类黄酮、类胡萝卜素和叶绿素,有红晕花被片的‘美人醉’和‘笑靥’品种含有花色苷,3个品种的花色素均以类黄酮居多。类黄酮、类胡萝卜素含量对黄色变化具有显著的影响,花色苷含量对红色变化具有显著的影响。(4)3个品种的可溶性蛋白对类黄酮、类胡萝卜素和花色苷的合成均有一定的促进作用,对花色苷合成促进有更加显著的效果;‘金颜帘卷’和‘笑靥’的中被片可溶性糖与类胡萝卜素、叶绿素呈显著正相关,对花色变化具有一定的影响,但对花色苷的合成并无明显促进作用;‘美人醉’和‘笑靥’的中被片、内被片SOD对其花的衰老具有一定的缓解作用,但对‘金颜帘卷’并无明显作用;‘美人醉’内被片和‘笑靥’的中被片、内被片蕾期花GSK2118436纯度色苷含量最高,其pH值最低,即低pH条件下花色苷稳定性更强,含量更高;‘金颜帘卷’花被片pH越高,黄色越明显。(5)3个品种的PAL、CHI活性均在开花前期的活性更高,色素合成代谢较活跃,因此蕾期和萌动期花色素含量较高。PAL、CHI活性与类黄酮、花色苷含量呈显著正相关,其活性越高越利于花色素的合成,且对花色苷的促进作用更加显著;PAL、CHI活性对3个品种的花色变化均有影响,但CHI活性与色度值之间的相关系数高于PAL,对花色变化的影响更加显著。(6)综合相关性分析和主成分分析说明,影响‘金颜帘卷’的中被片和内被片、‘美人醉’和‘笑靥’的中被片花色变化的主要花色素为类黄酮、类胡萝卜素和叶绿素;影响‘美人醉’和‘笑靥’的内被片花色变化的主要花色素为花色苷、类黄酮、类胡萝卜素和叶绿素,但花色苷含量的变化起着最直接的作用;可溶性蛋白、可溶性糖、植物pH、SOD、PAL和CHI等在花色变化的过程中也起到了重要的作用。关于蜡梅后续的花色改良和育种等方面,除了直接改变花色苷、类黄酮、类胡萝卜素和叶绿素的含量,也可以通过影响花被片细胞中蛋白和糖的含量、调节细胞液pH,或改变酶活性等方式,影响花被片中的花色素含量,达到花色改良的目的。

胆碱作为一种动物生长发育的必需营养素,在预防和治疗奶牛脂肪肝疾病中起重要作用,但其中的调节机制尚不清楚。本研究通过胆碱缺乏培养奶牛肝细胞,然后再补充胆碱,从蛋白质表达、脂质代谢和脂滴融合等方面研究胆碱调节奶牛肝细胞脂滴大小的机制,为阐明胆碱对奶牛脂肪肝的防治机制奠定基础。首先建立奶牛脂肪肝的细胞模型。在培养基中加入0、50、100、150、200、300、400mmol/L浓度的亚油酸处理24 h,通过CCK-8、油红O、尼罗红等方法检测,发现150mmol/L LA显著增加selected prebiotic library了牛肝细胞中TG的积累和脂滴的形成,后续试验选用150mmol/L LA处理牛肝细胞建立脂肪肝的细胞模型。随后通过胆碱缺乏培养基处理肝细胞,油红O染色细胞脂滴,荧光显微镜观察和计算脂滴大小、数量和比值。结果表明,与对照组相比,胆碱缺乏增加了脂滴的平均直径(1.59μm vs 2.10μm),其小脂滴(<2μm)的比例从74%下降到56.6%,大脂滴(>4μm)比例从5.3%增至15%。胆碱缺乏增加了肝细胞中TG含量(0.39μmol/mg vs 0.57μmol/mg)。蛋白分析发现固醇调节元件结合蛋白(SREBP)、固醇调节元素结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)、脂肪酸合成酶(FASN)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)的表达显著上调。采用活细胞工作站观察脂滴融合,发现缺乏胆碱处理后提高了脂滴的融合速度。薄层色谱显示,胆碱缺乏处理后,细胞总磷脂酰胆碱(PC)含量降低。液相色谱-质谱分析表明,胆碱缺乏导致27种磷脂酰乙醇胺(PE)化合物的含量增加,16种PC化合物的含量减少。为了进一步探讨胆碱对脂滴大小影响的作用机制,试验在缺乏胆碱的培养基中添加不同浓度的胆碱,观察对脂滴的影响。用0、30、60、90μmol/L氯化胆碱处理细胞后,发现随着胆碱的加入,脂滴的大小随着浓度的增加而减小,脂滴直径分别为2.37μm、1.54μm、1.43μm、1.39μm,细胞甘油三酯含量也KPT-330抑制剂逐渐下降,分别为0.65μmol/mg、0.45μmol/mg、0.36μmol/mg、0.37μmol/mg,同时细胞中PC的含量则逐渐增加。自噬蛋白检测结果表明,自噬标志物LC3蛋白的表达逐渐增加,而p62蛋白的表达则逐渐减少,表明PI3K抑制剂胆碱可能通过增加自噬水平来调控脂滴的大小。上述结果表明,胆碱缺乏增加了脂滴大小和脂滴融合,并影响了细胞磷脂组成和蛋白质表达。当加入胆碱时,细胞自噬活性逐渐增加,这导致脂滴的表型逆转。这一结果为阐明胆碱缓解围产期奶牛脂肪肝的应用机制提供数据支撑。

干旱是限制全球农业生产最主要的环境因素之一,干旱胁迫下植物会积累大量次生代谢物来抵抗逆境。东莨菪苷作为一种糖基化的香豆素,是植物中常见的次生代谢物,由UDP-葡萄糖基转移酶(UGT)催化合成。而东莨菪苷与植物耐旱性的关系尚不明晰。白花草木樨(Melilotus albus)是一种集饲用、绿肥、蜜源多用途的二倍体草本Medical drama series植物,是重要的轮作牧草,耐旱性强。然而,白花草木樨东莨菪苷生物合成基因及其是否通过调节东莨菪苷积累来提高植物耐旱性的分子机理尚且未知。本研究利用BSA(Bulked segregant analysis)、过表达以及RNAi(RNA interference)等方法开展参与白花草木樨东莨菪苷合成的UGT79基因鉴定、耐旱特性及MaMYB4和MabHLH11的转录调控研究,对阐明东莨菪苷的生物合成以及解析白花草木樨耐旱性强的分子机制具有重要意义。主要结果如下:1.全基因组水平鉴定了189个白花草木樨UGT基因家族成员。白花草木樨UGT基因家族成员不均匀地分布在8条染色体上。系统进化分析表明白花草木樨UGT可以分为13组,其中E组数量最多。共有76个MaUGT基因家族成员含有内含子序列,其中Inron-4(4号内含子)是高度保守的内含子。不同组织的转录组分析显示MaUGT在白花草木樨中具有组织表达特异性,16个MaUGT基因均在近等基因系JiMa46与JiMa49中差异表达,地上部和根中分别有73.55%和66.67%的MaUGT基因在非生物胁迫下差异表达,表明大多数MaUGT基因可能参与白花草木樨的发育、次生代谢产物的合成以及对非生物胁迫的响应。2.定位到东莨菪苷生物合成的关键基因MaUGT79。基于近等基因系BSA分析,将白花草木樨东莨菪苷生物合成基因定位到5号染色体67,539,223 bp至6Tezacaftor纯度7,540,565 bp区间内,该区间为一个编码UDP-葡萄糖基转移酶编码基因MaUGT79,该基因的编码区存在6个SNP和一个邻近的10 bp的Indel,这个Indel缺失能够引起移码突变导致蛋白翻译提前终止。MaUGT79在JiMa46和JiMa49的根中差异表达,且受干旱胁迫诱导表达。烟草亚细胞定位分析发现MaUGT79蛋白定位在细胞质和细胞核。证实体外重组蛋白MaUGT79能以UDP-葡萄糖为糖供体,以东莨菪内酯为底物,催化合成东莨菪苷。过表达MaUGT79显著增加了转基因毛状根中东莨菪苷含量,RNAi-MaUGT79则显著降低了转基因白花草木樨毛状根中东莨菪苷含量。在干旱胁迫处理下,过表达MaUGT79的转基因毛状根中丙二醛(MDA)、H_2O_2和O_2~-含量显著降低,东莨菪苷含量显著增加,干旱标记基因表达量显著上调,拥有转基因根系的白花草木樨嵌合体植株耐旱能力显著提高。初步证实MaUGT79介导白花草木樨东莨菪苷生物合成,通过干旱胁迫下清除活性氧从而提高植物耐旱能力。3.MaMYB4正调控MaUGT79表达调节东莨菪苷积累,从而提高植物耐旱性。MaUGT79启动子序列存在MYB类转录因子结合位点,生物信息学分析鉴定了一个候选转录因子MaMYB4。烟草亚细胞定位表明MaMYB4定位于细胞核。MaMYB4受干旱胁迫诱导表达。酵母单杂交(Yeast-one hybrid,Y1H)实验证明MaMYB4可以结合MaUGT79启动子的-1609至-1201 bp上游序列,进一步通过双荧光素酶报告(Dual-luciferase Reporter)实验证明,MaMYB4可以激活MaUGT79基因的表达。MaMYB4过表达转基因毛状根中,MaUGT79的相对表达量显著提高,东莨菪苷的含量显著高于对照。干旱胁迫下过表达MaMYB4转基因毛状根中MDA、H_2O_2和O_2~-含量显著降低,MaUGT79的表达则显著上调,拥有转基因根系的白花草木樨嵌合体植株耐旱能力显著提高;而RNAi转基因毛状根表现相反。由此,初步解析了转录因子MaMYB4结合MaUGT79启动子,上调该基因转录水平,进而正调控东莨菪苷生物合成和植物耐旱性的分子机制。4.MabHLH11转录因子可以和MaMYB4互作调控东莨菪苷积累。烟草亚细胞定位表明MabHLH11定位于细胞核。MabHLH11受干旱胁迫诱导表达。酵母双杂交(Yeast-two hybrid,Y2H)和双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescent Complimentary,BAdezmapimod分子式i FC)证明了MaMYB4能与MabHLH11互作。双荧光素酶报告实验、MaMYB4和MabHLH11共转化白花草木樨实验结果显示,MabHLH11和MaMYB4都可以激活MaUGT79的表达,并且MabHLH11和MaMYB4相互作用可以增加MaUGT79的表达,最终形成复合体促进东莨菪苷的积累。综上所述,本研究定位并鉴定了一个UDP-葡萄糖基转移酶基因MaUGT79,解析了该基因参与东莨菪苷生物合成和应答干旱胁迫的分子机制,发掘了上游调控因子MaMYB4,从而揭示干旱诱导MaMYB4调控MaUGT79表达及东莨菪苷积累的分子基础,进一步发现MabHLH11与MaMYB4互作并调控东莨菪苷的生物合成。本研究揭示了植物通过积累东莨菪苷适应干旱逆境的调控机制,为白花草木樨分子改良和种质创新提供重要的理论依据和基因资源。

目的：探讨再生障碍性贫血(AA)血清血小板生成素(TPO)、白细胞介素-17(IL-17)、γ-干扰素(IFN-γ)、促红细胞生成素(EPO)水平变化及意义。方法：回顾性分析2019年7月～2020年9月在天津市第一中心医院进行治疗的259例AA患者一般临床资料，将AA患者纳入试验组，选取同期健康体检者81例纳入对照组，比较两组一般临床资料，探讨血清IFN-γ、IL-17、EPO、TPO在AA中诊断价值。结果：试验组IFN-γ、IL-17、EPO、TPO均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。极重型患者血清IFN-γ、IL-17、EPO、TPO水平均显著高于非重型、重型患者，重型患者血清IFN-γ、IL-17、EPO、TPO水平高于非重型患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。原发性、继发性两组血清IFN-γ、IL-17、EPO、TPO水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后试验组患者血清IFN-γ、IL-17、EPO、TPO水平明显低于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)。血清IFN-γ、IL-17、EPO、TPO在预后评估中均具有一定价值GSK1120212作用(P<0Lorlatinib溶解度.05);Spearman相关性分析发现IFN-γ、IL-17、EPO、TPO均与RORγ1呈正相关(P<0.05)。结论：AA患者血清IFN-γ、IL-17、EPO、TPO水平均显著高于健康者，且指标间还arbovirus infection存在互相影响的情况，可为AA早期诊断及预后评估提供临床依据。

目的:基于葡聚糖凝胶微球(Dextran microspheres,DMs)构建一种具备体内栓塞可视化的~(131)I-Tyr-FAP-2286-DMs。通过建立兔VX2肝移植瘤动物模型,使用DMs、~(131)I-DMs和~(131)I-Tyr-FAP-2286-DMs对实验用兔进行介入栓塞治疗,探讨DMs介入栓塞以及关于~(131)I-DMs和~(131)I-Tyr-FAP-2286-DMs的经动脉放射栓塞(Transcatheter arterial radioembolization,TARE)对兔VX2肝移植瘤的治疗效果评估。方法:光镜下观察DMs的表观形态,测定钢筛筛选的20-70μm的DMs的粒径分布。通过酯化反应在DMs的羟基端引入酪氨酸连接的成纤维蛋白结合肽类似物(Tyr-FAP-2286),得Tyr-FAP-2286-DMs,并通过高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)测定载药率。DMs和Tyr-FAP-2286-DMs通过Iodogen法进行碘-125(Iodine-125,~(125)I)标记,并对核素累计释放量进行研究。DMs和Tyr-FAP-2286-DMs通过Iodogen法进行碘-131(Iodine-131,~(131)I)标记得~(131)I-DMs和~(131)I-Tyr-FAP-2286-DMs。准备36只成年新西兰大白兔,将兔间变表皮鳞癌(VX2)瘤块移植于肝脏,构建兔VX2肝移植瘤模型,依据氟[~(18)F]脱氧葡萄糖(~(18)Fluorine-fluorodeoxyglucose,~(18)F-FDG)正电子发射计算机断层扫描(Positron emission computed tomography/computed tomography,PET/CT)显像挑选入组模型。兔VX2肝移植瘤模型随机分组,每组2只分别进行DMs介入栓塞以及~(131)I-DMs和~(131)I-Tyr-FAP-2286-DMs的TARE治疗。通过0、10、24 h的单光子发射断层显像/X线计算机体层成像(Single photon emission computed tomography/computed tomography,SPECT/CT)显像评估~(131)I-DMs和~(131)I-Tyr-FAP-2286-DMs栓塞情况以及体内核素~(131)I分布情况。通过~(18)F-FDG PET/CT显像观察各组实验用兔体内~(18)F-FDG摄取情况,以评估肿瘤代谢活跃程度、治疗效果。术后15天取肝脏肿瘤及肿瘤周围组织进行病理研究。结果:DMs表面光整,呈圆形,粒径范围为20-70μm,平均粒径为32.41±9.08μm,适合用于TARE治疗。成功以酯化合成法制备得Tyr-FAP-2286-DMs,Tyr-FAP-2286的包封率可达55.52±7.60%,载药率为0.0278%。通过Iodogen法进行~(131)I标记制得~(131)I-DMs和~(131)I-Ferrostatin-1 IC50Tyr-FAP-2286-DMs。成功构建兔VX2肝移植瘤模型并通过~(18)F-FDG PET/CT显像验证兔VX2肝移植瘤模型。SPECT/CT显示~(131)I-DMs和~(131)I-Tyr-FAP-2286-DMs栓塞在体内稳定性良好,肝内肿瘤部位始终保持高放射性浓聚。术前与术后5天的~(18)F-FDG PET/CT显像结果显示~(131)I-Tyr-FAP-228selleckchem CL 3189526-DMs治疗后最大标准摄取(Maximum standard uptake value,SUV_(max))值变化率最大,为53.62±10.29%。病理结果显示~(131)I-Tyr-FAPpolyester-based biocomposites-2286-DMs治疗后肿瘤细胞出现大面积坏死、纤维化。结论:DMs的粒径大小符合TARE的要求。通过Iodogen法构建的~(131)I-Tyr-FAP-2286-DMs有良好的体内稳定性且通过SPECT/CT显像可以实现微球可视化,获得体内微球分布以评估栓塞效果、预测治疗效果。~(18)F-FDG PET/CT显像和病理检测结果显示,~(131)I-Tyr-FAP-2286-DMs对兔VX2肝移植瘤的治疗效果优于~(131)I-DMs和DMs,有效降低肿瘤活性,对肿瘤细胞有较强的杀伤作用。本研究优化了DMs的载药方式,为功能化TARE提供了可行性选择。