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众所周知,肿瘤是威胁人类健康的恶性疾病。声动力疗法(Sonodynamic therapy,SDT)作为一种新型的非侵入式肿瘤治疗方法,具有微创、无辐射、低成本和组织穿透能力强等优点,倍受科研工作者的青睐。SDT在超声(US)作用下,通过结合氧气(O_2)和声敏剂进而产生活性氧(Reactive oxygen species,ROS)诱导细胞凋亡。然而,SDT的疗效由于癌细胞存在抗凋亡机制而受到限制。因此,利用非凋亡性细胞死亡将为根除抗凋亡细胞的存活开辟新的治疗途径。受铁死亡和细胞凋亡协同抗肿瘤效果的启发,本文采用水热法合成了PCN-600,包载铁死亡诱导剂柳氮磺吡啶(SAS),再表面修饰含线粒体靶向基团三苯基膦(TPP)SAHA化学结构的短链,和能够被谷胱甘肽(GSH)断裂的含肿瘤靶向基团生物素的长链,制备GSHSmoothened Agonist核磁激活线粒体靶向功能的纳米系统(BSSTP@S)。线粒体是细胞凋亡和铁死亡的重要位置,BSSTP@S通过消耗肿瘤瘤内的GSH裂解长链的生物素暴露出TPP,再靶Probe based lateral flow biosensor向到癌细胞的线粒体。在US的激活下,BSSTP@S产生大量ROS并释放SAS,诱导细胞发生凋亡和铁死亡,从而提高SDT在体外和体内的抗肿瘤效果。本文合成的GSH激活的线粒体靶向纳米系统(BSSTP@S)为增强SDT的抗肿瘤疗效提供了一种新的途径。

目的研究靛蓝(IDG)对白细胞介素4(IL-4)诱导的小鼠单https://www.selleck.cn/products/ve-822.html核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)极化的影响。方法建立IL-4诱导的M2型巨噬细胞极化模型,分别用0.4μM、4μM、40μM的靛蓝干预细胞3天,用in vivo pathology蛋白质免疫印迹法(Western Blot法,WB)检测白细胞介素10(IL-10)、精氨酸酶1 (Arg-1)以及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的蛋白表达水平的变化;同时用实时荧光定量PCR检测一氧化氮合酶(iNOS)及Arg-1的mRNA表达水平。结果与模型组比较,经IDG干预后,靛蓝能够促进IL-4诱导的细胞Arg-1、IL-0的转录水平及IL-10的表达水平,抑制iNOS的转录水平及TNF-α的表达水平。结论 IDG能促进RAW264.7细胞向M2型巨噬细胞极化。此外,IDG显著抑制促炎因子的表达,并selleck化学且可以上调细胞中抑炎因子的水平。提示靛蓝具有一定的抗炎作用,从而可以治疗银屑病等以炎症为特征的疾病。

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是一种广泛存在于食品和饲料中的真菌毒素,受污染的农畜产品中的ZEN能通过食物链对人体健康构成极大威胁,且目前尚无治疗ZEN中毒的特效药,因此,真菌毒素防控成为重要的研究热点之一。微生物脱毒具有转化效率高、反应条件温和、不影响饲料品质等优点,是解决真菌毒素问题的研究重点。解淀粉芽孢杆菌具有潜在降解真菌毒素能力,分泌多种胞外酶,促进动物肠道健康和生长性能,在食物、制药、农业等方面已得到广泛应用。实验室分离菌株解淀粉芽孢杆菌H6具有bioethical issues抑制禾谷镰刀菌生长,并合成硫酯酶高效降解玉米赤霉烯酮的功能。但同其他微生物相似,分离于自然界的原始菌株可能存在安全性,发酵水平低等问题,并且解淀粉芽孢杆菌H6能否减轻ZEN诱导的小鼠毒性损伤及其机制仍不清楚。本研究以解淀粉芽孢杆菌H6为试验菌株,评估了菌株安全性,优化了菌株的发酵条件,验证了菌株对饲料中ZEN及ZEN衍生物脱毒效果,对降解ZEN最适反应条件进行探究,在小鼠体内对降解ZEN效果进行应用评价。试验—:解淀粉芽孢杆菌H6体外安全性评价通过测定解淀粉芽孢杆菌H6的体外安全特性,表明解淀粉芽孢杆菌H6不携带毒力基因bceT、cytK、ces、hblA、nheA,不具有硝酸还原酶活性,不具有赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸脱羧酶活性,对青霉素G、氨苄西林、头孢唑林、阿米卡星、庆大霉素、红霉素、诺氟沙星、环丙沙星、复方新诺明、氯霉素10种抗生素均敏感,不具有溶血活性。经毒力基因检测,代谢产物毒性检测,耐药性检测,溶血性检测等,均具有安全性。试验二:响应面法优化解淀粉芽孢杆菌H6及其硫酯酶的发酵工艺以活菌数和芽孢量为指标,采用响应面分析方法,对解淀粉芽孢杆菌H6的培养基和发酵条件进行了优化,同时应用qPCR方法对硫酯酶基因mRNA表达水平和蛋白活性进行评估,并测定其对玉米赤霉烯酮降解活性。通过单因素试验筛选出培养基组成的最优碳源、氮源、无机盐分别为可溶性淀粉、酵母浸粉、MgSO4。Plackett-Burman试验结果表明可溶性淀粉浓度、酵母浸粉浓度、发酵时间是发酵的关键因素。Box-Behnken试验最终确定培养基和发酵工艺的最优参数为:可溶性淀粉:32.16 g/L,酵母浸粉:16.27 g/L,MgSO4:10.00 g/L,发酵时间:39.28 h,初始 pH 为 5.0,接种量为1%,转速为200 r/min,发酵温度为37℃。经摇瓶验证解淀粉芽孢杆菌H6菌体生物产量达到6.33×109 CFU/mL,50L发酵罐Bafilomycin A1价格验证菌体产量达到1.09×1010 CFU/mL。通过响应面优化了解淀粉芽孢杆菌H6的发酵工艺,与初始培养基相比发酵水平显著提高(P<0.05),硫酯酶活性显著升高(P<0.05),为解淀粉芽孢杆菌H6的工业化发酵奠定了基础。试验三:解淀粉芽孢杆菌H6对玉米赤霉烯酮及其衍生物降解情况探究通过解淀粉芽孢杆菌H6发酵霉变饲料进行脱毒,结果表明ZEN含量为436.74 μg/Kg的霉变饲料经解淀粉芽孢杆菌H6发酵脱毒处理后,ZEN毒素含量降低到81.53 μg/Kg。通过Autodock分子对接预测,结果表明ZEN衍生物:α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇和玉米赤霉酮配体分子与硫酯酶蛋白可以靶向结合,进一步生物降解验证,表明解淀粉芽孢杆菌H6对α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇有降解效果。硫酯酶降解ZEN最适反应温度为37℃,最适反应pH为6.0,添加Fe2+、Mg2+、Mn2+三种金属离子能够显著提高了硫酯酶酶活(P<0.05),提升了对ZEN降解速率。试验四:解淀粉芽孢杆菌H6体内降解玉米赤霉烯酮应用评价将48只SPF昆明小鼠分为4组(对照组、ZEN组、H6组、H6+ZEN组)灌胃28天,测定其体重,肝脏系数,血清生化指标(谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶),肝脏氧化指数指标(丙二醛、总超购买PLX3397氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化氢酶),通过HE染色分析小肠和肝脏组织病理变化,检测肝脏Nrf-2氧化应激信号通路(Nrf-2、HO-1、γ-GCS、GSH-Px)mRNA相对表达水平,并测定盲肠内容物微生物16S rRNA。结果表明,ZEN能够降低小鼠生长性能,诱导小鼠肝脏氧化损伤,改变肝脏和小肠形态结构,产生病理变化,造成盲肠微生物变化。解淀粉芽孢杆菌H6能缓解ZEN引起的小鼠体重降低,逆转ZEN引起的与氧化应激相关的血清生化指标、肝脏氧化指数指标、以及Nrf-2信号通路mRNA相对表达水平,拮抗小鼠肝脏中ZEN诱导的氧化损伤。与ZEN组相比,H6菌株减轻了肝脏和小肠的病理损伤,在盲肠微生物组成上,解淀粉芽孢杆菌H6重塑了盲肠菌群结构,在小鼠体内具有应用效果,能够拮抗ZEN诱导的小鼠肝脏和肠道损伤,调节肠道菌群结构。

棉花是关系国计民生的重要物资。由大Anteromedial bundle丽轮枝菌引发的黄萎病严重影响棉花产量和品质的提高。挖掘棉花抗黄萎病的基因、创造新的棉花种质资源对棉花的可持续发展具有积极意义。本研究基于课题组前期的研究结果,分析海岛棉接种黄萎病菌之后差异表达的蛋白,鉴定到一个硬脂酰酰基载体蛋白去饱和酶(SACPD),其氨基酸序列与拟南芥AtSSI2的同源度高达78%,于是将其命名为Gb SSI2。通过序列比对,在陆地棉基因组中鉴定到了19个SSI2的同源基因。本研究对SSI2基因家族进行了系统分析,并对GhSSI2s在棉花中的功能进行了探索,取得的主要研究结果如下:1.利用拟南芥中已报道的AtSSI2(At2g43710)的蛋白序列作参比,在陆地棉基因组数库中鉴定到19个与其高度同源的基因。选择陆地棉中同源度大于70%的候选基因作为基因编辑的对象。根据基因进化关系对候选基因分组别进行CRISPR/Cas9基因敲除,通过selleckchem MLN8237棉花遗传转化获得四个组别的基因敲除材料。2.获得GhSSI2s敲除棉花材料。敲除植株生长较对照更加矮小,株型变得紧凑,结铃率上升,同时增强了棉花对黄萎病的抵抗能力。敲除植株种子中的油酸占比含量明显下降,脂肪酸总量变化不明显,说明该家族基因参与了棉花体内油酸的代谢。3.获得GhSSI2超表达棉花材料。转基因植株生长健壮,与转化受体Jin668和GhSSI2s敲除植株相比,其株高明显变高,根系更加粗壮;同时超表达植株出现异常生长的情况,在温室条件下叶枝异生成与主茎类似的“两个主茎”;在田间条件下,超表达植株表现为叶枝数量显著增加。代谢分析显示,超表达植株油酸占比含量上升,硬脂酸占比含量下降,说明超表达该基因促进了棉花体内硬脂酸向油酸的转化。超表达GH＿D05G3478对棉花抗黄萎病的能力影响不显著。4.敲除植株体内水杨diABZI STING agonist抑制剂酸(SA)含量明显高于对照和超表达植株,SA路径主要抗病基因表达量也明显升高;在接种黄萎病菌后,敲除植株SA相关基因被激活上调表达,上调程度显著高于另外两者,这有可能是其抗性增强的主要原因。超表达植株体内茉莉酸(JA)略低于对照,敲除植株的JA含量高于对照植株;在接种黄萎病菌后,敲除植株JA相关基因表达水平被抑制。综合以上研究结果,我们初步验证了GhSSI2s负调控棉花对黄萎病的抗性,为棉花抗黄萎病育种提供了新的种质资源和理论基础;超表达GhSSI2能促进棉花的营养生长,导致棉花出现两个“主茎”,可以为棉花株型改良提供参考。

氮素是植物生长发育至关重要的营养元素之一。农业上为了提高作物产量,往往会施加氮肥来保证氮素的供应,然而过度的氮肥施用会影响植株正常生长,出现土壤盐渍化、板结等问题。生长调控因子(growth-regulating factors,GRFs)对植物的生长发育具有重要的影响。本论文对番茄(Solanum lycopersicum)SlGRF4的作用机理和SlGRF4过表达转基因番茄在低氮下的功能进行研究。主要得到以下结果:1.低氮胁迫(0.2 m M)抑制番茄幼苗的生长,叶绿素含量下降,体内硝态氮含量显著下降。转录组分析发现低氮胁迫后有686个差寻找更多异表达基因;499个基因表达上调,187个下调;4个Sl GRF家族成员(Sl GRF1L、Sl GRF3、SlGRF4、SlGRF4L)表达量显著下调。差异基因富集分析发现,功能主要富集在胁迫响应、氮代谢调节等,代谢通路主要富集在氮代谢以及氨基糖与核苷糖代谢;氮代谢途径中的硝酸盐转运蛋白、碳酸酐酶、谷氨酸脱selleck产品氢酶显著上调,硝酸盐转运蛋白、亚硝酸盐还原酶、碳酸酐酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸合酶、谷氨酰胺合成酶显著下调。2.对SlGRF4进化树分析发现,Sl GRF家族分为4个亚家族,SlGRF4属于Class III。序列比对发现GRF包含高度保守QLQ结构域与WRC结构域。对SlGRF4的基因结构与启动子分析发现SlGRF4具有十分庞大的内含子序列,其启动子序列中含有激素、光响应元件以及MYB、MYC转录因子的结合位点。3.酵母双杂交实验发现SlGRF4能与Sl GIF家族的Sl GIF1、Sl GIgenetic elementsF2L、Sl GIF3发生蛋白互作。通过原核表达成功诱导出SlGRF4蛋白,并且还发现该蛋白能够发生S-亚硝基化修饰。EMSA实验证明SlGRF4能够结合到Sl KNOX2的启动子上,调控该基因的表达。4.成功获得SlGRF4过表达的转基因番茄,并对其在低氮下的功能进行分析。低氮胁迫下,SlGRF4过表达番茄种子发芽期的根长和鲜重较野生型(WT)显著增加。低氮(0.2 m M)处理15天后,与WT相比,SlGRF4过表达番茄叶片的H_2O_2和MDA含量低于WT,抗氧化物酶POD与CAT的活性、叶绿素a的含量、硝态氮含量、氮代谢途径中关键酶的基因(Sl NR、Sl GS、Sl GOGAT)表达量、NR与GS的酶活性高于WT。低氮处理后转录组分析发现,SlGRF4过表达番茄与WT相比差异基因达到了824个,其中340个基因上调、484个基因下调。功能富集GO分析的结果显示,SlGRF4过表达番茄更多的差异基因富集在了氧化还原酶活性上。通路富集KEGG分析的结果表明了过表达的株系在代谢通路中主要富集在氨基酸代谢。进一步对氮代谢途径进行分析,发现其中的四个关键酶(Sl NR、Sl Ni R、Sl GS、Sl GOGAT)的基因全部显著上调。差异转录因子的分析结果显示,在低氮处理后过表达株系有258个转录因子差异表达,其中有169个上调,89个下调,其中b HLH为差异转录因子最多的家族,有29个,其中20个上调,9个下调。

马立克氏病(Marek’s Disease,MD)是由马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus,MDV)感染鸡引起的以严重免疫抑制和内脏肿瘤为主要特征的疾病。MDV的基因组大小约为177kb,由一个长独特序列(U_L)区和一个短独特序列区(U_S),以及位于U_L两端的反向重复序列区(TR_L和IR_L)以及U_S两端的反向重复序列区(TR_S和IR_S)组成。位于U_L和U_S区的基因与其他疱疹病毒(HSV-1,VZV)具有高度的同源性,然而大多数基因的功能仍然未知。其中,LORF9是MDV编码的独特基因,早期研究表明,LORF9缺失导致MDV特超强毒株致病性显著降低,但其参与致病的分子机制仍不清楚。为了进一步明确LORF9在MDV致病过程中的作用以及探索参与致病的分子机制,本研究以超强毒株Md5BAC为亲本毒株,利用细菌人工染色体技术(Bacterial artificial chromosome,BAC)平台,通过Red两步同源重组技术构建了LORF9基因缺失(Md5BAC△LORF9)和回复突变株(Md5BAC△LORF9-Re)。为了探究LORF9基因缺失毒株在体内的致病作用,将1日龄的SPF鸡随机分成4组,未接种病毒组为阴性对照组,另外3组SPF鸡颈部皮下分别接种2,000 PFU的Md5BAC、Md5BAC△LORF9和Md5BAC△LORF9-Re病毒。利用荧光定量PCR(q PCR)检测感染后5、7、14、60 d脾脏中的病毒拷贝数,发现Md5BAC△LORF9的复制拷贝数比Md5BAC和Md5BAC△LORF9-Re显著降低。在感染后第14 d,与阴性对照组相比,Md5BAC和Md5BAC△LOR点击此处F9-Re感染鸡胸腺和法氏囊发生显著萎缩,而Md5BAC△LORF9感染鸡没有显著变化。对所有试验组的SPF鸡进行60 d的致病性监测,发现阴性对照组未发病,Md5BAC△LORF9组发病率为23.8%,死亡率为14.2%,而Md5BAC和Md5BAC△LORF9-Re感染的SPF鸡发病率分别为63.0%和84.2%,死亡率分别为44.4%和84.2%。为了进一步研究LORF9缺失与免疫保护相关,将1日龄的SPF鸡随机分成4组,其中2组分别颈部皮下免疫接种500 PFU的Md5BAC△LORF9和CVI988/Rispens病毒,接种后第5 d对免疫组和另外1组进行Md5BAC攻毒,未攻毒组为阴性对照组。在攻毒后第14 d,Md5BAC感染组的平均体重显著降低,但Md5BAC△LORF9组的平均体重与阴性对照组相比没有显著差异。Md5BAC感染组引起显著的免疫器官萎缩;在Md5BAC△LORF9或CVI988/Rispens免疫组中的鸡中均未发生免疫器官萎缩。在60 d的致病性监测中,阴性对照组未发病,Md5BAC感染组SPF鸡发病率为85%,死亡率为80%,Md5BAC△LORF9和CVI988/Rispens免疫组中免疫保护率分别为94.4%和93.7%。以上结果表明:LORF9缺失后MDV毒株具有较强的免疫保护力。为了进一步探索LORF9参与MDV致病的分子机制,通过RACE实验分析表明LORF9仅有一个转录本且大小与预测的开放阅读框序列一致,表明基因内无内含子;Western blot和q PCR检skimmed milk powder测结果表明,LORF9的表达随着病毒体外CEF细胞增殖而增加;而在体内病毒感染早期表达水平较高。细胞亚定位和核质分离试验结果表明LORF9在细胞质和细胞核中均有表达。转录组测序结果表明Md5BAC△LORF9感染显著引起免疫基因的表达变化,但进一步研究发现LORF9可能不参与调控天然免疫反应中的I型干扰素信号通路;对LORF9蛋白进行表观遗传验证,表明LORF9不能被Us3进行磷酸化修饰,但LORF9是一个泛素化蛋白,可以发生K48和K63泛素化修饰,同时MDV USP能够抑制LORF9的泛素化。综上所述,本研究成功构建了Md5BAC△LORF9基因缺失毒株和Md5BAC△LORF9-Re回复毒株,证明LORF9基因缺失不影响MDV体外增殖,但显著降低病毒体内复制和致病性。LORF9基因编码一个selleckchem Puromycin转录本并在细胞质和细胞核均有表达,通过转录组测序表明LORF9缺失后会显著改变机体免疫相关基因的表达,但进一步研究表明LORF9可能不参与调控天然免疫反应中的I型干扰素信号通路,LORF9是可以被K48和K63修饰的泛素化蛋白,且MDV USP能够抑制LORF9的泛素化。本研究为阐明MDV致病分子机制提供理论基础,也为MDV基因缺失疫苗的研发提供新思路。

肺癌在我国的发病率和死亡率居恶性肿瘤首位,然而大部分肺癌患者的直接死亡原因是肺癌共病,并非肺癌本身。癌症共病(Cancerco-comorbidities)通常被定义为除癌症外患有的其他急性或慢性疾病,包括心血管疾病、肝脏疾病、肾脏疾病、糖尿病、结缔组织疾病、神经系统疾病及自身免疫性疾病。超过75%的肺癌患者患有一种或多种共病。癌症共病不仅严重影响患者的生活质量,还会很大程度上限制癌症治疗策略的制定。目前认为,癌症共病的发生可能与癌症诱导的代谢异常和炎症有关,但其分子机制尚不清楚且缺乏有效的治疗药物。免疫检查点抑制剂(Immunecheckpointinhibitors,ICIs)能减弱抑制性的免疫检查点信号,导致抗肿瘤免疫反应的激活,因此对多种癌症具有强大的疗效。细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4(Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,CTLA4)和/或程序性死亡受体 1(Programmed cell death protein 1,PD-1)/程序性死亡-配体1(Programmed cell death-ligand 1,PD-L1)单抗已被批准用于治疗多种癌症,然而ICIs在改变了实体和血液系统恶性肿瘤治疗策略的同时,也可能导致一系列免疫介导的毒性,这些毒性被称为免疫相关不良事件(Immune-related adverse events,irAEs)。irAEs 可导致治疗中止、永久性组织器官损伤甚至是致命的后果。鉴于ICIs的应用越来越广泛,irAEs的发病率可能会进一步升高,因此,深入研究irAEs的发病机制尤为重要。人参皂苷Rd(Ginsenoside Rd,G-Rd)属于原人参二醇组皂苷,对神经系统、消化系统、内分泌系统、心血管系统和癌症均具有一定的生物学活性。G-Rd与类固醇激素有相同的母核,因而可能具有多种与类固醇激素相似的生物活性。本课题组前期研究发现,G-Rd可抑制脂多糖诱导Raw 264.7细胞炎症介质的释放,其抗炎活性与糖皮质激素地塞米松相当。因此推测G-Rd可能对炎症和免疫相关的疾病具有一定疗效。肝脏有利于血液代谢所需大分子的交换,可促进病理情况下免疫细胞的聚集和细胞因子风暴的发生,也是多数实体瘤转移的靶器官,预示着肝脏可能更易受到远端肿瘤和免疫细胞的影响。本研究以刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)诱导的小鼠免疫性肝炎(Immunehepatitis,IH)模型为基础探究Lewis肺癌(Lewis lungcancer,LLC)和/或PD-1单抗加重小鼠IH的机制,并探讨G-Rd的干预作用,以期为寻找肺癌与免疫性肝炎共病和PD-1单抗肝毒性的治疗靶点提供理论基础,同时也为G-Rd创新药物的开发和利用提供科学依据。一、Lewis肺癌加重ConA诱导小鼠免疫性肝炎的作用及机制研究研究方法:(1)10只雄性C57BL/6小鼠按体重随机分为空白对照(Ctrl)组和LLC组,每组5只。LLC组小鼠腹股沟皮下注射(s.c.)LLC细胞建立小鼠LLC移植瘤模型,Ctrl组不做处理。14d后ELISA检测各组小鼠心、肺、肝、肾、腓肠肌及结肠组织IL-1β和IFN-β含量。(2)32只雄性C57BL/6小鼠,其中16只s.c.接种LLC细胞,另16只不做处理。14 d后荷瘤小鼠按体重随机分为LLC组和ConA诱导IH与LLC共病(LLC+ConA)组,未接种小鼠分为Ctrl组和ConA组,每组8只。ConA组和LLC+ConA组小鼠尾静脉注射(i.v.)0.075%ConA溶液,20 mL/kg,建立ConA诱导的小鼠IH模型,Ctrl组和LLC组小鼠i.v.等体积生理盐水,24 h后取各组小鼠血清、血浆和肝脏。计算肝脏系数;拍照观察肝脏大体形态;H&E染色检测肝组织病理学;分光光度法检测血清ALT、AST及LDH活性;ELISA检测肝组织IL-1β、IL-18、IFN-β、cGAMP含量及血清MPO-DNA水平;QPCR检测肝组织CCL2、Cxcl1及IL-8 mRNA水平;荧光分光光度法检测血浆cfDNA水平;多重荧光免疫组化检测肝组织NETs水平;流式细胞术检测肝组织F4/80+巨噬细胞百分比;转录组测序检测肝组织全基因转录水平及差异基因kegg信号通路富集情况;Western Blot 检测肝组织 cGAS、STING、NLRP3、ASC、Casp1 及 cleaved Casp1蛋白表达水平。(3)24只雄性C57BL/6小鼠,其中12只s.c.接种LLC细胞,另12只不做处理。14 d后荷瘤小鼠按体重随机分为LLC+ConA组和DNase Ⅰ(LLC+ConA+DNase Ⅰ)组,未接种小鼠分为Ctrl组和ConA组,每组6只。LLC+ConA+DNaseⅠ 组小鼠腹腔注射(i.p.)1 U/μL DNaseⅠ,100 μL/只,30 min后 ConA、LLC+ConA 和 LLC+ConA+DNase Ⅰ组小鼠 i.v.0.075%ConA 溶液,20 mL/kg,建立ConA诱导的小鼠IH模型,Ctrl组小鼠i.v.等体积生理盐水,24 h后取各组小鼠血清、血浆和肝脏。计算肝脏系数;H&E染色检测肝组织病理学;分光光度法检测血清ALT、AST及LDH活性;流式细胞术检测肝组织F4/80+巨噬细胞百分比;荧光分光光度法检测血浆cfDNA水平;ELISA检测肝组织IL-1β、IL-18、IFN-β 含量及血清MPO-DNA 水平。(4)24只雄性C57BL/6小鼠s.c.接种LLC细胞,14 d后按体重随机分为LLC+ConA组、ConA诱导IH与LLC共病+对照氯膦酸盐脂质体(LLC+ConA+PBS-lip)组和ConA诱导IH与LLC共病+氯膦酸盐脂质体(LLC+ConA+Clo-lip)组,每组 8 只。LLC+ConA+PBS-lip 组小鼠 i.v.对照氯膦酸盐脂质体悬液,0.2 mL/只,LLC+ConA+Clo-lip组小鼠i.v.氯膦酸盐脂质体悬液,0.2 mL/只,24 h后各组小鼠i.v.0.075%ConA溶液建立ConA诱导小鼠IH模型,24 h后取血清、血浆及肝脏。流式细胞术检测肝组织F4/80+巨噬细胞百分比;计算肝脏系数;H&E染色检测肝组织病理学;分光光度法检测血清ALT、AST及LDH活性;荧光分光光度法检测血浆cfDNA水平;ELISA检测肝组织IL-1β、IL-18、IFN-β 含量、MPO-DNA 水平及血清 MPO-DNA 水平。(5)32只雄性C57BL/6小鼠,其中16只i.v.腺相关病毒(AAV)敲减肝脏内cGAS,另16只i.v.AAV对照载体。3 w后按体重随机取8只对照载体小鼠及8只cGAS敲减小鼠s.c.接种LLC细胞,分为ConA诱导IH与LLC共病+对照载体(LLC+ConA+Vec.)组和ConA诱导IH与LLC共病+cGAS敲减(LLC+ConA+cGAS-/-)组,剩余8只对照载体小鼠及8只cGAS敲减小鼠不做处理,分为ConA诱导IH+对照载体(ConA+Vec.)组、ConA诱导IH+cGAS敲减(ConA+cGAS-/-)组,每组8只。14 d后各组小鼠i.v.0.075%ConA溶液建立ConA诱导小鼠IH模型,24h后取血清、血浆及肝脏。QPCR检测肝组织cGAS mRNA水平;计算肝脏系数;H&E染色检测肝组织病理学;分光光度法检测血清 ALT、AST 及 LDH 活性;ELISA 检测肝组织 IL-1β、IL-18、IFN-β、cGAMP含量及血清MPO-DNA水平;Western Blot检测肝组织cGAS、STING、NLRP3、ASC、Casp1 及 cleaved Casp1 蛋白表达水平。研究结果:(1)与Ctrl组比较,LLC组小鼠肝组织IL-1β及IFN-β含量均显著升高(P<0.01),结肠组织IL-1β水平显著升高(P<0.01),其余各组织炎性细胞因子含量无明显变化(P>0.05)。(2)与Ctrl组比较,LLC组小鼠肝脏系数显著增大(P<0.05),肝组织无明显异常,肝组织IL-1β、IFN-β及cGAMP含量均显著升高(P<0.05或P<0.001),F4/80+巨噬细胞百分比升高,cGAS、STING、ASC、Casp1 及 cleaved Casp1 蛋白表达均显著上调(P<0.05),血清ALT、AST及LDH活性,MPO-DNA水平,血浆cfDNA荧光强度,肝组织IL-18含量,CCL2、Cxcl1、IL-8 mRNA水平及NLRP3蛋白表达均无明显变化(P>0.05),ConA组小鼠肝脏系数显著增大(P<0.001),肝组织有凝固性坏死,血清ALT、AST及LDH活性均显著升高,MPO-DNA水平显著升高(P<0.001),血浆cfDNA荧光强度显著增强(P<0.001),肝组织IL-1β、IL-18、IFN-β及cGAMP含量均显著升高,CCL2及IL-8 mRNA水平均显著升高(P<0.05,P<0.01或P<0.001),MPO及H3cit阳性表达增多,F4/80+巨噬细胞百分比升高,cGAS/STING/NLRP3炎性小体信号通路相关蛋白表达均显著上调(P<0.05或P<0.001),肝组织Cxcl1 mRNA水平无明显变化(P>0.05);与ConA组比较,LLC+ConA组小鼠肝组织有大量炎性细胞浸润,大面积出血及凝固性坏死,血清ALT、AST及LDH活性,MPO-DNA水平均显著升高(P<0.05或P<0.001),血浆cfDNA荧光强度显著增强(P<0.001),肝组织 IL-1β、IL-18、IFN-β 及 cGAMP 含量,CCL2、Cxcl1 及 IL-8 mRNA 水平均显著升高(P<0.05,P<0.01或P<0.001),MPO及H3cit阳性表达进一步增多,F4/80+巨噬细胞百分比升高,转录组测序结果显示LLC加重ConA诱导小鼠IH与NOD样受体信号通路和细胞质DNA感应通路有关,cGAS/STING/NLRP3炎性小体信号通路相关蛋白表达均显著上调(P<0.05或P<0.001),肝脏系数无明显变化(P>0.05)。(3)与LLC+ConA组比较,DNase Ⅰ能显著减小小鼠肝脏系数(P<0.001)改善肝组织病理学损伤,显著降低血清ALT、AST、LDH活性及MPO-DNA水平(P<0.001),显著减弱血浆cfDNA荧光强度(P<0.001),显著降低肝组织IL-1β、IL-18 及 IFN-β 含量(P<0.001)。(4)与LLC+ConA组比较,LLC+ConA+PBS-lip组小鼠肝脏系数,血清ALT、AST、LDH活性及MPO-DNA水平,血浆cfDNA荧光强度,肝组织IL-1β、IL-18、IFN-β含量及MPO-DNA水平均无明显变化(P>0.05),肝组织F4/80+巨噬细胞百分比与LLC+ConA组相当;与LLC+ConA+PBS-lip组比较,Clo-lip能降低小鼠肝组织F4/80+巨噬细胞百分比,显著减小肝脏系数(P<0.05),改善肝组织病理学损伤,显著降低血清ALT、AST及LDH活性(P<0.001),显著降低肝组织 IL-1β、IL-18、IFN-β 含量及 MPO-DNA 水平(P<0.001),但对血浆 cfDNA荧光强度及血清MPO-DNA水平无明显影响(P>0.05)。(5)与ConA+Vec.组比较,ConA+cGAS-/-组小鼠肝脏系数显著减小(P<0.01),肝组织病理学可见少量点、灶状坏死,血清ALT及AST活性均显著降低(P<0.001),肝组织cGAS mRNA水平,IL-18及cGAMP含量均显著降低(P<0.05),cGAS/STING/NLRP3炎性小体信号通路相关蛋白表达均显著下调(P<0.01或P<0.001),但血浆cfDNA荧光强度,血清LDH活性及MPO-DNA水平,肝组织IL-1β及IFN-β含量均无明显变化(P>0.05),LLC+ConA+Vec.组小鼠肝脏系数显著增大(P<0.01),肝组织有大面积灶状坏死,血清ALT、AST及LDH活性显著升高,MPO-DNA水平显著升高(P<0.001),血浆cfDNA荧光强度显著增强(P<0.01),肝组织 cGAS mRNA 水平,IL-1β、IL-18、IFN-β 及 cGAMP 含量均显著升高(P<0.05,P<0.01 或 P<0.001),cGAS/STING/NLRP3 炎性小体信号通路相关蛋白表达均显著上调(P<0.05或P<0.001);与LLC+ConA+Vec.组比较,LLC+ConA+cGAS-/-组小鼠肝脏系数显著减小(P<0.001),肝组织有大部分点状坏死,血清ALT、AST及LDH活性明显降低(P<0.001),肝组织cGAS mRNA 水平,IL-1β、IL-18、IFN-β 及 cGAMP 含量均显著降低(P<0.001),cGAS/STING/NLRP3炎性小体信号通路相关蛋白表达均显著下调(P<0.001),但血浆cfDNA荧光强度及血清MPO-DNA水平均无明显变化(P>0.05)。二、PD-1单抗加重ConA诱导小鼠免疫性肝炎的作用及机制研究研究方法:(1)32只雄性C57BL/6小鼠按体重随机分为Ctrl组、ConA组、IgG+ConA诱导 IH(IgG+ConA)组和 PD-1 单抗+ConA 诱导 IH(anti-PD-1+ConA)组,每组 8 只。anti-PD-1+ConA 组 i.p.0.05%PD-1 单抗,0.2 mL/只,IgG+ConA 组 i.p.等体积IgG对照,30 min后,除Ctrl组外,各组小鼠i.v.0.075%ConA溶液,20 mL/kg,建立ConA诱导小鼠IH模型,Ctrl组i.v.等体积生理盐水。24 h后取血清、血浆和肝脏。计算肝脏系数;拍照观察肝脏大体形态;H&E染色检测肝组织病理学;分光光度法检测血清ALT、AST及LDH活性;ELISA检测肝组织IL-1β、IL-18、IFN-β、cGAMP 含量及血清 MPO-DNA 水平;QPCR 检测肝组织 CCL2、Cxcl1及IL-8 mRNA水平;荧光分光光度法检测血浆cfDNA荧光强度;多重荧光免疫组化检测肝组织NETs水平;流式细胞术检测肝组织F4/80+巨噬细胞及PD-1+/F4/80+巨噬细胞百分比;Western Blot 检测肝组织 PD-1、cGAS、STING、NLRP3、ASC、Casp1 及 cleaved Casp1 蛋白表达水平。(2)24只雄性C57BL/6小鼠按体重随机分为anti-PD-1+ConA组、PD-1单抗+ConA 诱导 IH+PBS-lip(anti-PD-1+ConA+PBS-lip)组和 PD-1 单抗+ConA 诱导 IH+Clo-lip(anti-PD-1+ConA+Clo-lip)组,每组 8 只。anti-PD-1+ConA+PBS-lip组小鼠i.v.对照氯膦酸盐脂质体悬液,0.2 mL/只,LLC+ConA+Clo-lip组小鼠i.v.氯膦酸盐脂质体悬液,0.2 mL/只,24 h后各组小鼠i.p.0.05%PD-1单抗,30 min后,各组小鼠i.v.0.075%ConA溶液建立ConA诱导小鼠IH模型,24 h后取血清和肝脏。流式细胞术检测肝组织F4/80+巨噬细胞百分比;计算肝脏系数;H&E染色检测肝组织病理学;分光光度法检测血清ALT、AT-cell mediated immunityST及LDH活性。ELISA检测肝组织IL-1β、IL-18、IFN-β含量及MPO-DNA水平。(3)32只雄性C57BL/6小鼠,其中16只i.v.AAV敲减肝脏内cGAS,另16只i.v.AAV对照载体。3 w后按体重随机分为ConA+Vec.组、ConA+cGAS-/-组、PD-1单抗+ConA诱导IH共病+对照载体(anti-PD-1+ConA+Vec.)组和PD-1 单抗+ConA 诱导 IH 共病+cGAS 敲减(anti-PD-1+ConA+cGAS-/-)组,每组 8只。anti-PD-1+ConA+Vec.组及 anti-PD-1+ConA+cGAS-/-组小鼠 i.p.0.05%PD-1单抗,30 min后,各组小鼠i.v.0.075%ConA溶液建立ConA诱导小鼠IH模型,24h后取血清和肝脏。QPCR检测肝脏cGAS mRNA水平;计算肝脏系数;H&E染色检测肝组织病理学;分光光度法检测血清ALT、AST及LDH活性;ELISA检测肝组织IL-1 β、IL-18、IFN-β及cGAMP含量;Western Blot检测肝组织cGAS、STING、NLRP3、ASC、Casp1 及 cleaved Casp1 蛋白表达水平。研究结果:(1)与ConA组比较,IgG+ConA组小鼠肝组织有点、灶状坏死,肝脏系数,血清ALT、AST、LDH活性及MPO-DNA水平,血浆cfDNA荧光强度,肝组织 IL-1β、IL-18、IFN-β、cGAMP 含量,PD-1 蛋白表达,PD-1+/F4/80+巨噬细胞百分比及cGAS/STING/NLRP3炎性小体信号通路相关蛋白表达均无明显变化(P>0.05);与IgG+ConA组比较,PD-1单抗可加重小鼠肝组织病理学损伤,显著升高血清ALT、AST及LDH活性(P<0.001),显著升高肝组织IL-1β、IL-18、IFN-β及cGAMP含量、CCL2及Cxcl1 mRNA水平(P<0.01或P<0.001),降低 MPO 及 H3cit 阳性表达,显著升高 STING、NLRP3、Casp1 及 cleaved Casp1蛋白表达(P<0.01或P<0.001),但对肝脏系数、血浆cfDNA荧光强度及血清MPO-DNA水平、肝组织IL-8 mRNA水平、PD-1蛋白表达、PD-1+/F4/80+巨噬细胞百分比及cGAS、ASC蛋白表达均无明显影响(P>0.05)。(2)与 anti-PD-1+ConA 组比较,anti-PD-1+ConA+PBS-lip 组小鼠肝脏系数,血清ALT、AST及LDH活性,肝组织F4/80+巨噬细胞百分比,MPO-DNA水平,IL-1β、IL-18 及IFN-β 含量均无明显变化(P>0.05);与 anti-PD-1+ConA+PBS-lip组比较,Clo-lip能显著减小小鼠肝脏系数(P<0.05),改善肝组织病理学损伤,显著降低血清ALT、AST及LDH活性(P<0.001),显著降低肝组织IL-1β、IL-18、IFN-β 含量及 MPO-DNA水平(P<0.05 或P<0.001),降低肝组织 F4/80+巨噬细胞百分比。(3)与IgG+ConA+Vec.组比较,IgG+ConA+cGAS-/-组小鼠肝组织可见少量点、灶状坏死,血清ALT、AST及LDH活性均显著降低(P<0.001),肝组织cGAS mRNA 水平,IL-1β、IL-18、IFN-β 及 cGAMP 含量均显著降低,cGAS、STING及NLRP3蛋白表达均显著下调(P<0.05,P<0.01或P<0.001),肝脏系数、肝组织ASC、Casp1及cleaved Casp1蛋白表达有降低趋势但无显著性差异(P>0.05),anti-PD-1+ConA+Vec.组血清 ALT、AST 及 LDH 活性显著升高(P<0.001),肝组织 IL-1β、IL-18、IFN-β 及 cGAMP 含量均显著升高,NLRP3、Casp1及cleaved Casp1蛋白表达均显著上调(P<0.05或P<0.001),但肝脏系数,肝组织cGAS mRNA水平,cGAS、STING及ASC蛋白表达均无明显变化(P>0.05);与anti-PD-1+ConA+Vec.组比较,anti-PD-1+ConA+cGAS-/-组小鼠肝脏系数显著降低(P<0.05),血清ALT、AST及LDH活性显著降低(P<0.001),肝组织cGAS mRNA水平,IL-1β、IL-18、IFN-β及 cGAMP含量均显著降低,cGAS/STING/NLRP3炎性小体信号通路相关蛋白表达均显著下调(P<0.05,P<0.01 或P<0.001)。三、PD-1单抗加重ConA诱导Lewis肺癌小鼠免疫性肝炎的作用研究研究方法:32只雄性C57BL/6小鼠,其中16只s.c.接种LLC细胞,另16只不做处理。14 d后荷瘤小鼠按体重随机分为LLC+ConA组和PD-1单抗+ConA诱导IH与LLC共病(anti-PD-1+LLC+ConA)组,未接种小鼠分为Ctrl组和ConA组,每组 8 只。anti-PD-1+LLC+ConA 组小鼠 i.p.0.05%PD-1 单抗,0.2 mL/只,30 min后,除Ctrl组外,各组小鼠i.v.0.075%ConA溶液,20 mL/kg,建立ConA诱导小鼠IH模型,Ctrl组i.v.等体积生理盐水。24 h后取血清和肝脏。H&E染色检测肝组织病理学;DNA Damage/DNA Repair抑制剂分光光度法检测血清ALT、AST及LDH活性;ELISA检测肝组织 IL-1β、IL-18、IFN-β 及 cGAMP 含量;Western Blot 检测肝组织 cGAS、STING、NLRP3、ASC、Casp1 及 cleaved Casp1 蛋白表达水平。研究结果:与LLC+ConA组比较,PD-1单抗可加重小鼠肝组织病理学损伤,显著升高血清ALT、AST及LDH活性(P<0.05,P<0.01或P<0.001),显著升高肝组织IL-1β、IL-18、IFN-β 及 cGAMP 含量,显著上调 STING、NLRP3、Casp1 及 cleaved Casp1蛋白表达(P<0.05,P<0.01或P<0.001),但对cGAS及ASC蛋白表达无明显影响(P>0.05)。四、基于cGAS/STING/NLRP3炎性小体信号通路探讨人参皂苷Rd对免疫性肝炎小鼠的干预作用研究方法:32只雄性C57BL/6小鼠按体重随机分为Ctrl组、ConA组和G-Rd 10、20 mg/kg组,每组8只。各组小鼠分别i.p.G-Rd或等体积丙二醇-生理盐水,20 mL/kg,1次/d,连续给药2d。首次药后1h,除Ctrl组外,各组小鼠i.v.0.075%ConA溶液,20 mL/kg,建立ConA诱导小鼠IH模型,Ctrl组i.v.等体积生理盐水。24 h后取血清和肝脏。H&E染色检测肝组织病理学;分光光度法检测血清ALT、AST 及 LDH 活性;ELISA 检测肝组织 IL-1β、IL-18、IFN-β 及 cGAMP 含量;流式细胞术检测肝组织F4/80+巨噬细胞百分比;Western Blot检测肝组织cGAS、STING、NLRP3、ASC、Casp1 及 cleaved Casp1 蛋白表达水平。研究结果:与ConA组比较,G-Rd 10、20 mg/kg均可减轻小鼠肝组织病理学损伤,显著降低血清ALT、AST及LDH活性(P<0.001),显著降低肝组织IL-1β、IL-18、IFN-β及cGAMP含量(P<0.05或P<0.001),降低肝组织F4/80+巨噬细胞百分比,G-Rd20mg/kg 能显著下调肝组织 cGAS、STING、NLRP3、ASC、Casp1及cleaved Casp1蛋白表达(P<0.05,P<0.01或P<0.001),G-Rd 10 mg/kg能显著下调肝组织 STING 蛋白表达(P<0.01),cGAS、NLRP3、ASC、Casp1 及 cleaved Casp1蛋白表达有降低趋势,但无显著性差异(P>0.05)。五、基于cGAS/STING/NLRP3炎性小体信号通路探讨人参皂苷Rd对Lewis肺癌加重ConA诱导小鼠免疫性肝炎的干预作用研究方法:(1)32只雄性C57BL/6小鼠,其中24只s.c.接种LLC,另8只不DS-3201核磁做处理。14 d后荷瘤小鼠按体重随机分为LLC+ConA组和G-Rd 10、20 mg/kg组,未接种小鼠为ConA组,每组8只。各组小鼠i.p.相应剂量G-Rd或等体积丙二醇-生理盐水,20 mL/kg,1次/d,连续给药2 d,首次药后1 h各组小鼠i.v.0.075%ConA溶液,20 mL/kg,建立ConA诱导的小鼠IH模型,24 h后取血清和肝脏。H&E染色检测肝组织病理学;分光光度法检测血清ALT、AST及LDH活性;ELISA检测肝组织IL-1 β、IL-18、IFN-β及cGAMP含量;Western Blot检测肝组织cGAS、STING、NLRP3、ASC、Casp1 及 cleaved Casp1 蛋白表达水平。(2)32只雄性C57BL/6小鼠,其中16只i.v.AAV过表达肝脏内cGAS,另16只i.v.AAV对照载体。3 w后将16只cGAS过表达小鼠按体重随机分为ConA 诱导 IH 与 LLC 共病+cGAS 过表达(LLC+ConA+cGASOE)组和 ConA 诱导 IH 与 LLC 共病+G-Rd 20 mg/kg+cGAS 过表达(LLC+ConA+G-Rd+cGASOE)组,16只对照载体小鼠按体重随机分为ConA诱导IH与LLC共病+对照载体(LLC+ConA+Vec.)组和 ConA 诱导 IH 与 LLC 共病+G-Rd 20 mg/kg+对照载体(LLC+ConA+G-Rd+Vec.)组,每组 8 只。各组小鼠 i.p.20 mg/kg G-Rd 或等体积丙二醇-生理盐水,20mL/kg,1次/d,连续给药2d,首次药后1h各组小鼠i.v.0.075%ConA溶液建立ConA诱导小鼠IH模型,24 h后取血清和肝脏。QPCR检测肝组织cGAS mRNA水平;H&E染色检测肝组织病理学;分光光度法检测血清 ALT、AST 及 LDH 活性;ELISA 检测肝组织 IL-1β、IL-18、IFN-β 及 cGAMP含量;Western Blot 检测肝组织 cGAS、STING、NLRP3、ASC、Casp1 及 cleaved Casp1蛋白表达水平。研究结果:(1)与LLC+ConA组比较,G-Rd 10、20 mg/kg均可改善小鼠肝组织病理学损伤,显著降低血清ALT、AST及LDH活性(P<0.001),显著降低肝组织IL-1β、IL-18、IFN-β 及 cGAMP 含量(P<0.001),显著下调 cGAS/STING/NLRP3炎性小体信号通路相关蛋白表达(P<0.05,P<0.01或P<0.001)。(2)与LLC+ConA+Vec.组比较,LLC+ConA+cGASOE组小鼠肝组织有大面积凝固性坏死,血清ALT、AST及LDH活性均显著升高(P<0.001),肝组织cGAS mRNA 水平,IL-1β、IL-18、IFN-β 及 cGAMP 含量均显著升高,cGAS、STING、Casp1 及 cleaved Casp1 蛋白表达均显著上调(P<0.05,P<0.01 或P<0.001),但NLRP3及ASC蛋白表达无明显变化(P>0.05),LLC+ConA+G-Rd+Vec.组小鼠肝组织形态趋于正常,血清ALT、AST及LDH活性均显著降低(P<0.05或P<0.001),肝组织 cGAS mRNA 水平,IL-1β、IL-18、IFN-β 及 cGAMP 含量均显著降低,cGAS、NLRP3、ASC、Casp1及cleaved Casp1蛋白表达均显著下调(P<0.05,P<0.01或P<0.001),STING蛋白表达无明显变化(P>0.05);与LLC+ConA+G-Rd+Vec.组比较,LLC+ConA+G-Rd+cGASOE 组小鼠肝组织有凝固性坏死,大量炎性细胞浸润,血清ALT、AST及LDH活性显著升高(P<0.001),肝组织cGAS mRNA水平,IL-1β、IL-18、IFN-β及cGAMP含量均显著升高(P<0.05,P<0.01或P<0.001),cGAS/STING/NLRP3炎性小体信号通路相关蛋白表达均显著上调(P<0.01或P<0.001)。六、基于cGAS/STING/NLRP3炎性小体信号通路探讨人参皂苷Rd对PD-1单抗加重ConA诱导Lewis肺癌小鼠免疫性肝炎的干预作用研究方法:(1)40只雄性C57BL/6小鼠,其中32只s.c.接种LLC细胞,另8只不做处理。14 d后荷瘤小鼠按体重随机分为LLC+ConA组、anti-PD-1+LLC+ConA组和G-Rd 10、20 mg/kg组,未接种小鼠为ConA组,每组8只。各组小鼠i.p.相应剂量G-Rd或等体积生理盐水,20 mL/kg,1次/d,连续给药2 d,首次药后30 min,anti-PD-1+LLC+ConA 组和 G-Rd 10、20 mg/kg 组小鼠 i.p.0.05%PD-1 单抗,0.2 mL/只,30 min 后各组小鼠 i.v.0.075%ConA 溶液,20 mL/kg,建立 ConA诱导的小鼠IH模型,24h后取血清和肝脏。H&E染色检测肝组织病理学;分光光度法检测血清ALT、AST及LDH活性;ELISA检测肝组织IL-1β、IL-18、IFN-β 及 cGAMP 含量;Western Blot检测肝组织 cGAS、STING、NLRP3、ASC、Casp1及cleaved Casp1蛋白表达水平。(2)32只雄性C57BL/6小鼠,其中16只i.v.AAV过表达肝脏内cGAS,另16只i.v.AAV对照载体。3 w后所有小鼠接种LLC细胞,14 d后将16只cGAS过表达小鼠按体重随机分为PD-1单抗+LLC与ConA诱导IH共病+cGAS过表达(anti-PD-1+LLC+ConA+cGASOE)和 PD-1 单抗+ConA 诱导 IH 与 LLC 共病+cGAS 过表达+G-Rd20mg/kg(anti-PD-1+LLC+ConA+G-Rd+cGASOE)组,16只对照载体小鼠按体重随机分为PD-1单抗+ConA诱导IH与LLC共病+对照载体(anti-PD-1+LLC+ConA+Vec.)组和 PD-1 单抗+ConA 诱导 IH 与 LLC 共病+对照载体+G-Rd 20 mg/kg(anti-PD-1+LLC+ConA+G-Rd+Vec.)组,每组 8 只。各组小鼠i.p.G-Rd 20 mg/kg或等体积丙二醇-生理盐水,20 mL/kg,1次/d,连续给药2 d,首次药后30 min各组小鼠i.p.0.05%PD-1单抗,0.2 mL/只,30 min后各组小鼠i.v.0.075%ConA溶液,20 mL/kg,建立ConA诱导的小鼠IH模型,24 h后取血清和肝脏。QPCR检测肝组织cGAS mRNA水平;H&E染色检测肝组织病理学;分光光度法检测血清ALT、AST及LDH活性;ELISA检测肝组织IL-1β、IL-18、IFN-β 及 cGAMP 含量;Western Blot检测肝组织 cGAS、STING、NLRP3、ASC、Casp1 及 cleaved Casp1 蛋白表达水平。研究结果:(1)与 anti-PD-1+LLC+ConA 组比较,G-Rd 10、20 mg/kg 均能改善小鼠肝组织病理学损伤,显著降低血清ALT、AST及LDH活性(P<0.01或P<0.001),显著降低肝组织 IL-1β、IL-18、IFN-β 及 cGAMP 含量(P<0.001),G-Rd20mg/kg能显著下调cGAS/STING/NLRP3炎性小体信号通路相关蛋白表达(P<0.05或P<0.001),G-Rd 10 mg/kg 能显著下调 STING、NLRP3、ASC 及 cleaved Casp1蛋白表达(P<0.05,P<0.01或P<0.001),可下调cGAS及Casp1蛋白表达,但无显著性差异(P>0.05)。(2)与 anti-PD-1+LLC+ConA+Vec.组比较,anti-PD-1+LLC+ConA+cGASOE组小鼠肝组织凝固性坏死面积更大,血清ALT、AST及LDH活性均显著升高(P<0.01 或P<0.001),肝组织 cGAS mRNA水平,IL-1β、IL-18、IFN-β 及 cGAMP含量均显著升高(P<0.05,P<0.01 或 P<0.001),cGAS/STING/NLRP3 炎性小体信号通路相关蛋白表达均显著上调(P<0.05,P<0.01或P<0.001),anti-PD-1+LLC+ConA+G-Rd+Vec.组小鼠肝组织病理学损伤减轻,血清ALT、AST及LDH活性显著降低(P<0.01或P<0.001),肝组织IL-1β、IL-18、IFN-β及cGAMP含量均显著降低(P<0.05或P<0.001),cGAS、NLRP3及cleaved Casp1蛋白表达均显著下调(P<0.05或P<0.001),cGAS mRNA水平,STING、ASC及Casp1蛋白表达有下调趋势,但无显著性差异(P>0.05);与anti-PD-1+LLC+ConA+G-Rd+Vec.组比较,anti-PD-1+LLC+ConA+G-Rd+cGASOE组小鼠肝组织有大量炎细胞浸润,血清ALT、AST及LDH活性显著升高(P<0.05,P<0.01或P<0.001),肝组织cGAS mRNA水平,IL-1β、IL-18、IFN-β及cGAMP含量均显著升高,cGAS/STING/NLRP3炎性小体信号通路相关蛋白表达均显著上调(P<0.01或P<0.001)。结论:1.LLC可促进肝脏巨噬细胞百分比和NETs水平升高,上调cGAS表达并升高其活性,从而激活cGAS/STING/NLRP3炎性小体信号通路,加重ConA诱导小鼠IH。2.PD-1单抗在不改变肝脏巨噬细胞百分比的情况下,可促进巨噬细胞吞噬NETs,升高cGAS活性,从而激活cGAS/STING/NLRP3炎性小体信号通路,加重ConA诱导小鼠IH。3.PD-1 单抗可加重ConA诱导LLC小鼠IH,其机制与激活cGAS/STING/NLRP3炎性小体信号通路有关。4.G-Rd可降低小鼠肝脏cGAS蛋白表达及活性,抑制cGAS/STING/NLRP3炎性小体信号通路激活,从而缓解ConA诱导小鼠IH、LLC加重ConA诱导小鼠IH和PD-1单抗加重ConA诱导LLC小鼠IH,提示G-Rd对免疫性肝炎与肺癌共病以及PD-1单抗的肝毒性具有明显的保护作用。综上所述,本研究为肝脏疾病与肺癌共病和PD-1单抗肝毒性的治疗提供了新的思路,同时为人参皂苷Rd作为保肝药物的开发和利用提供了科学依据。

目的探讨蒙药蓝刺头对兔骨髓间充质干细胞(rabbit bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)体外增殖和成骨分化的影响;运用低温三维打印(three-dimensional printing,3D)技术联合冷冻干燥技术,复合聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)、纳米羟基磷灰石(nano hydroxyapatiten,nHA)、氧化石墨烯(graphene oxide,GO)制备骨组织工程支架,分析支架的理化性能及体外细胞相容性,评估其作为骨组织修复支架材料的可行性;以蓝刺头作为促成骨分化因素,初步探讨蓝刺头诱导种子细胞rBMSCs与PLGA/nHA/GO支架共培养复合体的体外成骨性能,以期为开发新型骨缺损修复支架提供参考;基于网络药理学及分子对接技术初步研究蓝刺头影响成骨分化的活性成分、作用靶点及可能机制,以期为后续药效物质和作用机制研究提供新的思路及参考依据。方法1.蒙药蓝刺头对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响制备蓝刺头冻干粉。采用CCK-8法检测不同浓度蓝刺头对rBMSCs增殖及活力的影响,并根据实验结果筛选培养基最适含药浓度进行后续实验。设置对照组为完全培养基培养、模型组为成骨诱导分化培养基培养、给药组为含0.01 mg/m L蓝刺头冻干粉的成骨诱导分化培养基培养。不同处理组分别连续干预rBMSCs 7 d、14 d后,采用偶氮法(para-nitrophenyl phosphate,pNPP)检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,BCIP/NBT法(5-bromo-4-chloro-3-inodlyl-phosphate,BCIP/Nitro-Blue-Tetrazolium,NBT)观察ALP染色情况;连续干预14 d、21 d后,采用茜素红染色法(alizarin red staining,ARS)观察基质矿化购买NVP-TNKS656情况并进行定量检测,实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测成骨分化相关指标Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(bone gla protein,BGLAP)、Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen,COL-I)及ALP mRNA的表达情况。2.3D打印骨组织工程支架的制备及其性能评价配置材料配比,设置PLGA组、PLGA/nHA组及PLGA/nHA/GO组,探索低温3D打印参数并联合冷冻干燥技术制备多孔支架。观察各组支架的大体形态,对支架宏观孔隙的孔径及孔隙率进行表征,通过扫描电镜观察支架微观形貌,运用机械试验机检测各组支架的力学性能,称重支架吸水前后质量并依据公式计算12 h内的吸水率,对各组支架降解过程中的质量变化、pH变化进行测定;将rBMSCs接种至各组支架,对支架的细胞黏附率、细胞毒性、细胞增殖情况进行检测。3.蒙药蓝刺头诱导兔骨髓间充质干细胞与3D打印支架体外共培养复合体的构建及成骨性能研究构建细胞-支架体外共培养复合体,设置A组为常规完全培养基培养的rBMSCs接种于PLGA/nHA/GO支架共培养,B组为成骨诱导分化培养基培养的rBMSCs接种于PLGA/nHA/GO支架共培养,C组为含0.01 mg/m L蓝刺头的成骨诱导分化培养基培养的rBMSCs接种于PLGA/nHA/GO支架共培养。各组分别共培养4 d、7 d后采用pNPP法检测ALP活性;共培养7 d后采用RT-qPCR法检测成骨分化相关基因ALP、RUNX2、OPN、COL-I及BGLAP的表达情况。4.基于网络药理学及分子对接探讨蒙药蓝刺头影响成骨分化的作用机制4.1基于网络药理学预测蒙药蓝刺头影响成骨分化的作用机制以CNKI、Pubmed等为主要数据库检索有关蒙药蓝刺头的所含化学成分,筛选其活性成分以及其相关靶点;运用Gene Cards及OMIM数据库筛选成骨分化相关靶点;通过Venn Diagram取交集得到蓝刺头活性成分与成骨分化相关的潜在作用靶点,利用Cytoscape构建药物-活性成分-交集靶点网络图;并运用Cluster Profiler对潜在作用靶点进行基因本体(gene ontology,GO)生物功能富集分析以及京都基因与基因组百科(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路富集分析;通过STRING数据库构建潜在作用靶点的蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,并利用Cytoscape筛选核心靶点。4.2基于分子对接技术验证蒙药蓝刺头影响成骨分化的机制依据4.1构建的PPI网络图,并通过MNC及EPC算法分别计算核心基因,与成骨分化相关信号通路基因取交集得交集基因。再结合上述分析得到的信号通路及互作蛋白,构建PPI-pathway网络,筛选出该网络中的共同相关基因。从GEO数据库中检索到成骨分化数据集,通过统计学t检验筛选出在成骨诱导分化前后出现显著差异表达的基因,作为分子对接的候选基因。运用Auto Dock进行分子对接验证筛选出的关键靶点与蓝刺头活性成分之间的结合情况。结果1.蒙药蓝刺头对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响CCK-8实验结果显示,与其余各组相比,浓度0.01 mg/m L蓝刺头组的吸光度值明显升高(P<0.05)。分别干预7 d、14 d后,与对照组比较,模型组及给药组均能够提高ALP活性水平(P<0.05),ALP染色着色深、范围大,且给药组比模型组效果更为明显(P<0.05),同时各组均存在一定时间依赖性(P<0.05);分别干预14 d、21 d后,与对照组比较,模型组及给药组ARS染色着色深、范围大,钙定量吸光度值大(P<0.05),均可上调成骨分化相关基因RUNX2、OPN、BGLAP、COL-I及ALP mRNA的相对表达量(P<0.05),且给药组比模型组效果更为明显(P<0.05),同时各组均存在一定时间依赖性(P<0.05)。2.3D打印骨组织工程支架的制备及其性能评价探索的打印参数适宜,成功制备成型的三维多孔PLGA、PLGA/nHA、PLGA/nHA/GO支架。PLGA及PLGA/nHA支架呈乳白色,加入GO后颜色略微偏灰;PLEnzyme InhibitorsGA支架外观挛缩较为严重,PLGA/nHA与PLGA/nHA/GO支架外观形态较为规整。俯视时支架宏观孔隙的孔径随着nHA和GO的加入而减小(P<0.05),PLGA组为(535±59)μm,PLGA/nHA组为(453±18)μm,PLGA/nHA/GO组为(343±24)μm;正视时各组支架孔径差异无统计学意义(P>0.05);三组支架孔隙率差异无统计学意义(P>0.05),均在70%左右。扫描电镜观察,三组支架表面均存在微观孔隙结构,PLGA组支架表面整体较平滑,微孔尺寸较小、深度较浅;PLGA/nHA及PLGA/nHA/GO组复合支架表面较粗糙,密集分布尺寸大小不一的大量微孔,其中添加GO的复合支架表面的凸凹形貌更为明显。力学测试结果显示,PLGA组支架的压缩模量最小(P<0.05),为(6.91±0.96)MPa;nHA的加入显著提高了复合支架的压缩模量,PLGA/nHA组支架的压缩模量为(9.13±1.27)MPa,PLGA/nHA/GO组支架为(8.93±1.27)MPa,两组差异无统计学意义(P>0.05)。24 h内吸水率测定结果显示,三组支架均表现为前6 h吸水率不断增加,6 h之后基本处于缓慢上升的平衡状态;12 h内PLGA/nHA/GO组支架吸水率最高(P<0.05)。支架的降解性能检测中,随着降解时间的延长,三组支架的质量损失率、降解速度均呈递增趋势;在降解2 w时三组支架的质量损失率及降解速度均较小(P>0.05),降解至检测结束的各时间点,PLGA组支架的质量损失率及降解速度均远大于另外两组复合支架(P<0.05),另外两组复合支架的质量损失率差异无统计学意义(P>0.05),PLGA/nHA/GO组支架的降解速度略大于PLGA/nHA组支架(P<0.05);随着降解时间的延长,三组支架降解液的pH基本均呈减小趋势,PLGA组支架的降解液逐渐降低至弱酸性,且pH值均远小于另外两组复合支架(P<0.05),PLGA/nHA组及PLGA/nHA/GO组复合支架的pH值在降解检测时间内稳定在7.1-7.4之间(P>0.05)。支架的生物相容性检测中,三组支架的细胞黏附率均随着接种时间的延长呈递增趋势,8 h时PLGA/nHA组及PLGA/nHA/GO组复合支架表现出较高的早期黏附能力(P<0.05),之后PLGA/nHA/GO组支架的细胞黏附率最高(P<0.05),PLGA组最低(P<0.05);细胞毒性检测结果显示,24 h时三组支架材料的浸提液对细胞相对增殖率无明显差别(P>0.05),细胞毒性分级均为0级;细胞增殖检测结果显示,随着培养时间的延长三组支架上的细胞均不断增殖(P<0.05),PLGA/nHA/GO组支架的OD值均远大于另外两组(P<0.05),PLGA组最低(P<0.05)。3.蒙药蓝刺头诱导兔骨髓间充质干细胞与3D打印支架体外共培养复合体的构建及成骨性能研究各组细胞-支架复合体分别共培养4 d、7 d后的ALP活性测定结果显示,仅使用完全培养基培养的A组也存在ALP活性表达;三组间的ALP活性表达差异均具有统计学意义(P<0.05),与完全培养基培养的A组相比,使用成骨诱导分化培养基的B组及C组ALP活性升高(P<0.05);与未添加蓝刺头的B组相比,添加蓝刺头的C组ALP活性水平提升;各对应组两时间点分别进行比较,ALP活性均有提升(P<0.05)。各组细胞-支架复合体共培养7 d后的RT-qPCR结果显示,与常规完全培养基培养的A组相比,使用成骨诱导分化培养基的B组及C组的各检测基因mRNA表达水平几乎均有不同程度增加(P<0.05);与未添加蓝刺头的B组相比,添加蓝刺头的C组的各检测基因mRNA表达水平提高,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.基于网络药理学及分子对接探讨蒙药蓝刺头影响成骨分化的作用机制4.1基于网络药理学预测蒙药蓝刺头影响成骨分化的作用机制筛选得到蓝刺头活性成分31个,蓝刺头活性成分靶点692个,成骨分化相关靶点1924个,蓝刺头活性成分成骨分化潜在作用靶点275个;GO生物学功能富集分析共得到2630个条目,包括2443个生物过程条目、51个细胞组分条目及136个分子功能条目,KEGG信号通路富集分析共得到164条信号通路。PPI网络显示8377对互作关系,筛选出度值排名LBH589 IC50前15位的关键靶点分别为TP53、AKT1、MYC、CTNNB1、TNF、JUN、STAT3、VEGFA、IL6、EGFR、CASP3、INS、SRC、IL1B、PTEN。4.2基于分子对接技术验证蒙药蓝刺头影响成骨分化的机制筛选得到分子对接候选基因IL6、PTEN;分子对接结果显示,关键靶点IL6与活性成分槲皮素及芹菜素、关键靶点PTEN与活性成分芹菜素之间具备相对较好的结合活性。结论1.蒙药蓝刺头具有能够促进体外培养条件下rBMSCs增殖及成骨分化的作用。2.运用低温3D打印技术联合冷冻干燥技术,配比PLGA、nHA、GO为原料,成功制备出三维多孔支架。其中,PLGA/nHA/GO复合支架具备更为优异的孔径与微观形貌,初始机械强度适宜,具有优异的吸水率及适宜的降解性能,且体外细胞相容性良好,具备进一步开发为骨组织工程支架材料的潜能。3.以蒙药蓝刺头作为促成骨分化因素,共培养rBMSCs-PLGA/nHA/GO支架复合体能够促进成骨分化,有望为骨组织工程领域骨再生修复提供新的思路。4.网络药理学证实蓝刺头通过多成分、多靶点、多通路发挥影响成骨分化作用,分子对接结果显示蓝刺头可能是通过活性成分槲皮素调控关键靶点IL6、芹菜素调控靶点IL6、PTEN而发挥影响成骨分化的作用。

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以呕吐、腹泻、脱水为主要特征的一种高度接触性肠道传染病,给我国养猪业带来严重的经济损失。疫苗是防控PEDV的首选策略,但因病毒变异速度快、流行毒株多、疫苗研发滞后等问题,导致PED在我国猪群中频繁发生。因此,开展PEDV抗病毒药物等相关研究十分必要。金丝桃苷(hyperoside),广泛分布在多种植物果实及全草中,具有抗炎、抗菌和抗病毒等生物活性。本实验室前期研究发现金丝桃苷在体外通过拮抗PEDV N蛋白和p53蛋白相互作用,干预PEDV N蛋白介导宿主细胞S期阻滞抑制PEDV复制。山楂(Crataegus pinnatifida Bunge),富含金丝桃苷等物质,是一种“药食同源”植物,可作为提取金丝桃苷的理想来源。基于以上,本研究通过单因素、响应面试验明确山楂中金丝桃苷的最佳提取条件,并进一步通过体内外实验确证山楂中金丝桃苷抗PEDV作用及机制,为抗PEDV药物的开发提供理论依据。1.山楂中金丝桃苷的提取、纯化和鉴定为明确山楂中金丝桃苷的最佳提取条件,本研究采用单因素和响应面试验确定乙醇回流提取金丝桃苷的最佳条件为:乙醇浓度为70%,提取时间为120 min,固液比为1:19(g/m L),提取温度为81℃。在此条件下,山楂中金丝桃苷的提取率最大,为0.42 mg/g。采用大孔树脂HP-20、Sephadex-LH20凝胶柱纯化山楂中金丝桃苷粗提物,其纯度最终为98.79%。采用紫外光谱、红外光谱和质谱对纯化后的金丝桃苷提取物进行鉴定,紫外光谱结果显示,金丝桃苷提取物在250 nm和360 nm附近处出现与金丝桃苷标准品一致的特征吸收峰;红外光谱结果显示,金丝桃苷提取物在3 305、1 656、1 608、1 506、1 365、1 259和1 091 cm~(-1)处有与金丝桃苷标准品一致的吸收峰;质谱结果图显示,金丝桃苷提取物产生一个高纯度的分子离子峰m/z 462,该分子离子峰与金丝桃苷标准品一致。2.山楂中提取的金丝桃苷抗PEDV作用的研究为明确山楂中金丝桃苷抗PEDV作用,本研究通过细胞毒性测定、半数毒性浓度(CC_(50))测定,Western blot、TCID_(50)测定、半数有效浓度(EC_(50))测定等技术方法,分析金丝桃苷在Vero E6细胞上对PEDV复制的影响。结果显示,浓度为5.00μg/m L的山楂中金丝桃苷对Vero E6细胞无细胞毒性,山楂中金丝桃苷的CC_(50)为25.15μg/m L;与PEDV HM2017感染对照组相比,5.00μg/m L山楂中金丝桃苷能显著降低PEDV N蛋白表达(p<0.01);5.00μg/m L山楂中金丝桃苷处理组的PEDV HM2017病毒滴度为3.76 loVP-16纯度g_(10)TCID_(50)/m L,显著低于对照组的病毒滴度(4.79 log_(10)TCID_(50)/m L)(p<0.01);山楂中金丝桃苷的EC_(50)为2.59μg/m L,SI为9.71。为进一步明确山楂中金丝桃苷体内抗PEDV感染作用,本试验通过最佳给药剂量筛选和哺乳仔猪攻毒试验,评价山楂中金丝桃苷体内抗PEDV HM2017感染效果。结果显示,浓度低于500 mg/kg的山楂中金丝桃苷对小鼠存活率、体重、红细胞、白细胞和血小板等指标无影响。在攻毒48 h后,山楂中金丝桃苷组仔猪存活率为75%(3/4),PEDV感染对照组仔猪存活率为0%(0/4);与PEDV感染对照组仔猪相比,山楂中金丝桃苷可以减轻攻毒仔猪临床症状、肠道病理损伤;山楂中金丝桃苷组仔猪肛门拭子12 h、36 h的病毒载量分别为10~(6.58)copies/m L、10~(5.41)copies/m L,空肠和回肠病毒载量分别为10~(6.11)copies/g、10~(5.70)copies/g,显著低于PEDV感染对照组仔猪肛门拭子12 h(10~(7.48)copies/m L)、肛门拭子36 h(10~(7.12)copies/m L)、空肠(10~(7.44)copies/g)和回肠(10~(6.67)copies/g)病毒载量;显著抑制攻毒仔猪回肠中PEDV N蛋白的表达(p<0.05)。上述结果表明,山楂中金丝桃苷在体内外对PEDV具有抑制作用。3.山楂中提取的金丝桃苷抗PEDV作用机制的确证PEDV N蛋白与p53相互作用介导宿主细胞S期阻滞,进而促进病毒复制,金丝桃苷标准品能够拮抗PEDV N蛋白与p53相互作用,干预细胞S期阻滞进而抑制病毒复Tregs alloimmunization制。为确证山楂中金丝桃苷抗PEDV作用的机制,本研究通过体内外实验,采用Co-IP、Western blot等技术方法,分析山楂中金丝桃苷抗PEDV作用的机制。体外实验结果显示,在Vero E6细胞上,与PEDV感染对照组相比,5.00μg/m L山楂中金丝桃苷可以显著降低p53和p21蛋白表达(p<0.01),显著提高cyclin A蛋白表达(p<0.05),显著抑制PEDV N蛋白与p53相互作用(p<0.05)。体内实验结果显示,与PEDVCaptisol感染对照组仔猪相比,山楂中金丝桃苷显著抑制攻毒仔猪回肠中p53蛋白表达(p<0.05),显著抑制PEDV N蛋白与p53蛋白相互作用(p<0.05)。上述结果表明,山楂中金丝桃苷通过抑制PEDV N蛋白与p53相互作用,干预宿主细胞周期S期阻滞,进而发挥抗PEDV作用。综上所述,从山楂中成功提取到高纯度的金丝桃苷,山楂中提取的金丝桃苷通过抑制PEDV N和p53蛋白相互作用干预病毒介导宿主细胞周期阻滞在体内和体外发挥抗PEDV作用,为绿色廉价高效的抗PEDV天然药物开发奠定理论基础。

皮质醇是人类主要的糖皮质激素,在应激生理适应、能量动员和免疫反应的调节中起着至关重要的作用,也被用作合成其他糖皮质激素的中间体。皮质醇的化学法合成涉及步骤繁多且收率低,在目前的MLN8237作用工业生产中主要采用半合成方法,其中向11-脱氧皮质醇引入11β-OH生产皮质醇主要用真菌培养物进行微生物转化。然而,真菌催化过程的选择性较差,常伴随着其他位置羟基化副产物的产生,且培养和转化时间均较长。因此,开发替代生物催化剂以更专一且更高效地将11β-羟基引入合成糖皮质激素中,极具工业应用价值。本文以人源线粒体11β-羟化酶P450CYP11B1为研究对象,构建了大肠杆菌重组表达系统用于高效生物催化生成皮质醇,从重组蛋白外源表达条件和全细胞反应条件优化、P450氧化还原伴侣工程和蛋白质分子改造等方面出发,进行了一系列酶工程方向的应用基础研究。为了解决高等真核生物来源P450系统在原核生物外源表达过程中存在的表达量低和稳定性差等问题,首先对CYP11B1及其同源氧化还原伴侣牛AdR和牛Adx在大肠杆菌中的表达载体和多顺反子表达顺序进行优化。然后,在最适表达载体和表达顺序下,通过调整RBS序列来协调三种蛋白的相对表达强度,筛选出最佳RBS组合。随后,对细胞培养条件进行了单因素优化,包括培养温度、诱导条件和培养基组成等,得到最佳培养条件。最后,在全细胞反应体系中,比较了不同细胞膜助渗透剂和底物助溶剂对细胞催化活性的影响,并在优选助溶剂的应用下提升反应体系底物浓度。通过表达和反应条件的优化,成功将皮质醇LGK-974作用的时空产率由初始的343.6 mg·L-1·d-1提升至优化后条件下的1470.0 mg·L-1·d-1。随后,对CYP11B1的氧化还原伴侣进行工程改造,以期得到可提升电子传递速率的最佳氧化还原伴侣,从而提升全细胞催化效率。首先将天然自给自足酶P450BM3和P450RhF的还原酶域与CYP11B1进行融合表达,形成人工自给自足P450,但融合酶导致了CYP11B1活性的完全丧失。随后选择不同来源的四组氧化还原伴侣与CYP11B1进行共表达,构建了不同铁氧还蛋白与氧还蛋白还原酶的交叉组合,不同的元件组合显示出了对全细胞催化活性影响的显著差异。最后引入两种不同类型的分子支架CipB和PCNAs,期望通过自组装功能形成高效电子通道,但也未显示出对提升催化活性的正向作用。虽然氧还伴侣工程的尝试并未直接提升全细胞催化活性,但证明了氧化还原伴侣元件替换对提升P450酶催化效率的潜力。最后,对CYP11B1进行了分子改造,以期提高其催化活Malaria immunity性。基于对CYP11B1分子结构的认识,选定构成底物通道的部分残基,并通过丙氨酸扫描寻找影响底物进出的关键位点。利用理性设计手段对底物结合口袋内的不同区域进行位点改造,以期拉近底物C11和血红素-Fe之间的距离。但这两方面的多个突变体未显示出对活性提升的有利影响,甚至部分突变造成了活性严重丧失。随后通过应用计算设计工具提升了CYP11B1蛋白的可溶性和稳定性,多个突变体表现出催化活性的提升,其中三点突变体M3(S169V/H354D/L463F)使皮质醇的时空产率达到2756.3 mg·L-1·d-1,是目前已知此类生物转化类型获得的最高皮质醇产率的3.3 倍。本项工作显著提升了依赖于CYP11B1的生物催化法对11-脱氧皮质醇进行专一 11-β羟基化生成皮质醇的产率,进一步挖掘了微生物法高效生产皮质醇的潜力。同时,在研究过程中开发的工艺优化、氧化还原伴侣工程和酶工程策略为其他基于P450催化的甾体化合物生物合成提供了参考。