急性胰腺炎(Acute pancreatitis,AP)是以胰腺腺泡损伤为起源,不同程度累及邻近组织和远端脏器的消化系统疾病,当伴有广泛的胰腺坏死时,具有不可预测性和潜在致命性。过度或反复的腺泡细胞损伤在引起胰腺坏死的同时释放大量的促炎介质和炎症趋化因子,继发胰腺坏死感染、全身炎症反应和器官功能衰竭等,可进展为重症急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis,SAP),病情凶险,死亡率居高不下,临床救治难度颇高,均造成了目前沉重的医疗资源负担和社会经济压力。众所周知,AP是一种细胞死亡相关的疾病,胰酶激活所致腺泡细胞的损伤和死亡是AP典型的病理损伤特征。一旦腺泡细胞损伤诱发细胞死亡,可引起细胞膜破裂并释放内容物(蛋白酶,氧化物等),刺激炎症因子的释放,而加重胰腺局部损伤甚至引起全身炎症反应等。早期凋亡的细胞协同一些损伤性分泌物质包括氧化代谢产物、酶原颗粒、炎症因子等吸引活化的巨噬细胞快速募集到炎症损伤部位,此过程被称之为“胞葬”(Efferocytosis)。胞葬作为炎症消退反应的关键武器,可有效保护继发的细胞坏死及炎症反应,参与调控动脉粥样硬化,自身免疫性疾病等疾病的进展。然而,AP状态下凋亡的腺泡细胞是如何被机体清除,以及潜在的干预方案,至今未被充分阐明。最近研究发现CD47,一类称为细胞表面“不要吃我”信号分子的跨膜蛋白,在动脉粥样硬化的病变血管细胞中过表达,并伴随着凋亡细胞不可逆性死亡,使得具有清除能力的巨噬细胞功能受损,产生抗“胞葬作用”,加剧炎症反应,显著增加病重病死率。在这项研究中,我们首次针对早期受损腺泡细胞(凋亡细胞)及巨噬细胞“胞葬作用”的相关性并探究其在AP中的分子调控机制。在这里,我们首次证实胰腺坏死与CD47的表达上调密切相关,且CD47作为一个关键的“不要吃我”信号,抑制其表达(基因干预或药理学方法)具有潜在的治疗AP的作用。我们进一步阐明了清除凋亡腺泡细胞(即“胞葬”)和胰腺坏死的功能,机制以及临床相关性,具体如下:①在人和小鼠AP胰腺组织中,我们通过免疫荧光染色,WB和qPCR观察到CD47表达水平的变化,通过透射电子显微镜和共聚焦激光扫描显微镜证实AP后存在胞葬现象;②我们构建CD47敲除小鼠、应用抗CD47中和抗体、miRNA激动剂、胰腺特异性AAV-pan等来调节CD47表达并促进巨噬细胞对凋亡腺泡细胞的胞葬作用保护雨蛙素诱导的AP小鼠的胰腺坏死。此外,我们应用胆管结扎(BDL)构建了一个重症急性胰腺炎小鼠模型来模拟人类临床急性胆源性胰腺炎。同样地,我们也在BDL诱导的小鼠AP模型中观察到CD47表达上调,胞葬增加。抑制CD47(CD47敲除小鼠和抗CD47中和抗体)可改善胰腺组织坏死和炎症反应,使小鼠地生存率提高;selleck③CD47的表达受TRIM28/miR133a调节,并且调控TRIM28/miR133a/CD47分子轴在Cae-AP中的促胞葬效应得到验证;④我们建立了共培养体系,在体外模拟了一个细胞间相互作用的吞噬状态,进一步证实TRIM28/miR133a严格调节CD47参与胞葬作用。所有研究结果表明,CD47介导的胞葬对预防胰腺坏死至关重要,这表明CD47的靶向调节在AP治疗中具有临床意义。研究内容分为以下三个章节:第一章急性胰腺炎中存在胞葬且CD47表达上调目的:明确CD47在急性胰腺炎小鼠及人胰腺组织中表达情况。方法:我们通过腹腔注射雨蛙素构建急性胰腺炎小鼠模型,分别在第一针雨蛙素后6h,12h,24h留取小鼠血及胰腺组织,并同时留取对照小鼠血和胰腺组织。选取6h急性胰腺炎小鼠胰腺组织和对照小鼠胰腺组织进行RNA-seq测序,随后根据测序结果进行后续qPCR检测。对所有时间点的急性胰腺炎小鼠胰腺组织进行H&E染色并检测血清淀粉酶,脂肪酶水平。同时提取胰腺组织蛋白和RNA,进行WB和qPCR检测CD47蛋白和mRNA水平。通过透射电子显微镜观察巨噬细胞吞噬情况,通过激光共聚焦显微镜扫描观察小鼠胰腺组织胞葬情况(腺泡细胞凋亡TUNEL染色和巨噬细胞Mac3染色共定位)。将急性胰腺炎小鼠和对照小鼠胰腺组织进行CD47和Amylase免疫荧光染色。此外,我们通过美国Biomax公司购买了人胰腺炎组织芯片,并收集我院胰腺癌手术病人癌旁组织作为正常对照。同样的对人胰腺组织进行H&E染色,CD47免疫组化染色,Mac3/TUNEL免疫荧光染色,并分析了胰腺组织CD47表达水平及胰腺坏死的相关性。结果:小鼠胰腺组织RNA-seq测序显示共10493个基因改变,其中5360个基因升高,5133个基因下调。对所有差异基因进行GO组分分析提示“Phagocyotosis”通路,即“吞噬”通路,改变明显(NES+2.0922,P=0.0012)。通过GSEA分析提示急性胰腺炎小鼠炎症免疫反应相关通路及“Phagocyotosis”所在的细胞死亡相关通路改变明显。火山图和热图针对“Phagocyotosis”通路差异基分析,结果提示胞葬相关分子(主要指参与巨噬细胞对凋亡细胞的清除的分子)CD47及配体SIRPα在急性胰腺炎小鼠胰腺组织显著上调。而目前已知的四类与胞葬相关的“不要吃我”信号分子mRNA水平显示,CD47和CD31表达升高,且CD47升高达20余倍。免疫荧光和WB也证实了 CD47蛋白水平主要高表达在损伤的腺泡细胞中且与疾病严重程度呈正相关。我们在急性胰腺炎小鼠胰腺组织中观察到巨噬细胞活化并吞噬了坏死内容物(死亡细胞及碎片,损伤线粒体,溶酶体等)。Mac3/TUNEL免疫荧光染色观察到小鼠急性期巨噬细胞浸润增加,存在胞葬现象。我们在急性胰腺炎患者中同样观察到了 CD47高表达于损伤腺泡细胞,也存在胞葬现象。结论:上述结果表明,胞葬现象和损伤腺泡细胞高表达CD47是急性胰腺炎的标志性特征,CD47可能作为未来临床防治急性胰腺炎的新靶点。第二章靶向抑制CD47介导胞葬作用在急性胰腺炎小鼠胰腺坏死中保护性作用目的:抑制CD47在小鼠急性胰腺炎中的保护性作用;体内外实验验证抑制CD47在受损的腺泡细胞中的早期清除作用(即胞葬作用)。方法:我们应用CRISPER/Cas9技术构建CD47敲除小鼠,引入已经进入临床研究的抗CD47中和抗体,使用上述两种方法靶向干预CD47。并应用雨蛙素和胆管结扎构建急性胰腺炎小鼠模型,留取血清和胰腺组织,检测血清酶学(淀粉酶,脂肪酶)水平和血清炎症因子水平。通过透射电子显微镜观察巨噬细胞吞噬情况,通过激光共聚焦显微镜扫描观察小鼠胰腺组织胞葬情况(腺泡细胞凋亡TUNEL染色和巨噬细胞Mac3染色共定位)。此外,在我们分离雨蛙素诱导的AP小鼠胰腺组织内免疫细胞,通过流式染色检测巨噬细胞活化情况。体外实验部分,我们同时在在原代腺泡细胞和266-6腺泡细胞进行实验。首先,检测抑制CD47对腺泡细胞坏死的影响。提取骨髓来源的巨噬细胞,应用MCSF诱导成熟后与损伤的腺泡细胞建立共培养体系。收集巨噬细胞进行流式检测观察靶向抑制CD47对巨噬细胞胞葬作用的影响(直接提取CD47 KO腺泡细胞,或应用抗CD47中和抗体以及siCD47基因干预)。结果:两种方法抑制CD47表达(CD47敲除小鼠,抗CD47中和抗体)均可以促进胞葬作用(腺泡细胞凋亡TUNEL染色和巨噬细胞Mac3染色共定位显著增加),保护急性胰腺炎小鼠胰腺坏死,降低血清酶学水平及炎症因子水平(MCP1,IL6和TNFα)。流式染色结果提示,抑制CD47也可以减少巨噬细胞浸润情况并改变小鼠胰腺组织内免疫微环境,促进巨噬细胞向M2型极化,抑制巨噬细胞向促炎M1型极化。在体外共培养实验中,靶向抑制CD47可以上调巨噬细胞胞葬水平保护胰腺坏死,对损伤腺泡细胞上清LDH释放无影响。同样地,我们也观察到了抑制CD47可以改变巨噬细胞活化状态,与体内实验结果一致。结screen media论:抑制CD47可促进巨噬细胞胞葬作用,保护急性胰腺炎小鼠胰腺坏死,降低炎症反应。第三章靶向抑制CD47介导胞葬在急性胰腺炎胰腺坏死中的分子机制研究目的:明确CD47介导地胞葬效应地上游调控分子及其在急性胰腺炎中地作用。方法:通过TargetScan 8.0计算模拟预测CD47上游调控分子miRNA及其调控位点。应用模拟肽(体内agomir,体外mimic和inhibitor)上调或抑制miRNA的表达,并通过FISH染色,qPCR及WB验证表达情况。应用雨蛙素或胆囊收缩素建立体内体外急性胰腺炎模型,通过H&E染色和血清酶学,血清炎症因子观察调控上游调控分子对急性胰腺炎的作用。通过TEM和CLSM观察胰腺组织内胞葬现象,流式检测体外巨噬细胞胞葬水平。随后在266-6细胞转染mimic-RNA,胆囊收缩素建立体外AP模型。同时加入抗CD47中和抗体,设立对照IStaurosporine使用方法gG,观察上游调控分子对CD47表达的调控及巨噬细胞胞葬作用的影响。进一步通过miRwalk寻找调控miRNA上游转录调控分子,并验证其在胞葬中的作用。结果:TargetScan 8.0计算模拟预测CD47上游调控分子为miR133a,应用agomir-miR133a显著上调了胰腺组织内miR133a的表达(FISH染色和qPCR均观察到miR133a表达上调5倍),CD47蛋白水平及mRNA水平下调。上调miR133a表达可以促进胞葬作用(腺泡细胞凋亡TUNEL染色和巨噬细胞Mac3染色共定位显著增加),保护急性胰腺炎小鼠胰腺坏死,降低血清酶学水平。体外实验上调miR133a可以促进巨噬细胞胞葬水平,而同时应用抗CD47中和抗体,胞葬上调效应被抵消。进一步miRWalk提示miR133a上游调控分子为TRIM28,应用TRIM28敲除(shTRIM28)小鼠胰腺组织TRIM28及CD47蛋白水平显著下降,miR133amRNA水平上调。TRIM28敲除(shTRIM28)保护雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠胰腺损伤,降低炎症反应。TRIM28敲除(shTRIM28)可以促进体内外巨噬细胞胞葬作用,在体外实验中,应用抗CD47中和抗体或模拟肽inhibitor-miR133a,胞葬上调效应被抵消。结论:上述结果阐明调节受损腺泡细胞胞葬作用的分子信号轴,即TRIM28/miR133a/CD47 信号轴。