实验目的:针对单碱基KRAS-G12D突变的检测,我们首先选用了等温扩增技术对目的片段进行扩增,然后通过运用滚环扩增技术和金纳米颗粒对突3-Methyladenine价格变信号进一步放大,构建了基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的比色生物传感器用于精准诊断KRAS-G12D基因突变,以期满足即时诊断(POCT)的需求。研究方法:首先通过RPA反应对KRAS-G12D突变的模板进行扩增,并同时在模板中引入Cas9蛋白切割所需的PAM识别序列;接着通过构建能够在原核细胞中表达Cas9蛋白的载体,使Cas9蛋白在IPTG的诱导下进行表达,并用梯度浓度的咪唑进行纯化步骤;在分别对Sg NA序列和RCA反应中Padlock序列等实验条件优化后,用柠檬酸钠还原的方法制备胶体金纳米颗粒作为信号放大器,通过静电吸附相互作用的方式在金纳米颗粒表面吸附链霉亲和素修饰的辣根过氧化物酶(hGNPs),通过透射电子显微镜、紫外吸收光谱对hGSmoothened Agonist细胞培养NPs进行表征;在对该生物传感器的灵敏度和特异性分析完成后,还进一步通过模拟的生物样本判断了该比色生物传感器在临床检验诊断的应用潜力。研究结论:首先,在RPA反应过程中,我们成功地对目的片段进行了扩增,并将PAM位点引入了扩增片段,保证了Cas9蛋白对靶标的精准识别以及特异性切割;其次,通过结合优化后的CRISPR/Cas切割系统和滚环扩增反应,该比色传感器大大提高了检测的特异性,降低了非特异性信号的产生;此外,该检测系统经过多重的信号放大,不仅保证了zebrafish bacterial infection对KRAS野生型及其他突变检测的特异性,还大大提高了KRAS-G12D检测的灵敏度,使得其检测线可低至0.2 f M;最后,在对模拟的临床样本的检测中,该比色生物传感器在不借助任何分析仪器的情况下,通过肉眼观察即可检测出0.01%的突变概率。