RNA解旋酶是一类广泛存在于所有生命体中的马达蛋白,利用ATP水解供能来调节RNA结构以及RNA和蛋白复合体(RNA molecules and proteins,RNP)。DEAD-box蛋白是RNA解旋酶中最大的一类蛋白家族,它们参与了RNA相关的几乎所有代谢过程。其中,人的DDX5和酵母的Dbp2定义了一类DEAD-box亚家族,DDX5/Dbp2亚家族的蛋白参与细胞中转录调控、能量代谢和细胞信号通路。近年来,许多研究发现DDX5与癌症的发生和发展密切相关。此外,DDX5的一种小分子抑制剂已被开发用于乳腺癌患者的治疗。因此,DDX5对于生物医学的研究十分重要。目前,在DDX5/Dbp2亚家族蛋白结构的研究中,只解析了DDX5的Rec A1结构域的晶体结构,而其他结构域的三维结构信息是不清楚的。DEAD-box蛋白的解旋酶核心由13个保守的特征基序组成,这些基序在ATP结合、水解以及RNA结合中发挥重要的作用。除了这些保守基序以外,每个DEAD-box亚家族都有独特的末端尾部,分别位于解旋酶核心的N-和C-末端。由于每个DEAD-box亚家族的末端尾部是特异性的,而解旋酶核心的结构十分相似,因此详细地研究DDX5/Dbp2亚家族特异性末端尾部的功能具有重要的意义。本研究选择酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Dbp2为研究对象,通过大肠杆菌表达系统成功表达和纯化到高纯度的目的蛋白。Dbp2蛋白的体外生化活性研究表明,大肠杆菌表达纯化的酵母Dbp2蛋白是一个真实的RNA解旋酶。接着,通过蛋白序列的生物信息学分析、各种截短体蛋白以及限制性蛋白酶水解的致密片段进行了晶体学的研究,从而获得Dbp2蛋白的晶体结构。此外,本研究通过荧光偏振、快速停留、单分子技术、荧光标记蛋白和荧光光谱等方法,系统地探究了Dbp2蛋白末端结构域的功能以及全长蛋白调节RNA结构的分子机制。主要获得了以下结果:(1)本研究获得了第一个Dbp2解旋酶核心以及与ADP复合的晶体结构,分别代表了https://www.selleck.cn/products/byl719.htmlDbp2蛋白在解旋循环中的单蛋白状态和ATP水解后的状态。在Dbp2~(53-496)的晶体结构中,观察到独特的CTE(carboxy terminal extension)构象和保守的NTE(amino terminal extension)构象,并且结合体外突变体实验进一步证实了NTE和CTE调节Dbp2蛋白的体外ATP水解活性。(2)基于晶体结构中观察到Dbp2解旋酶核心的构象变化,将全长Dbp2蛋白的解旋酶核心进行荧光标记并通过单分子技术,发现全长Dbp2蛋白的解旋酶核心在溶液中是动态变化的;同时结合了ATP类似物和ss RNA后,解旋酶核心的构象处于关闭状态。此外,通过蛋白质分子内交联的方法将解旋酶核心锁定在关闭的构象,体外解旋酶活性实验进一步证明了Dbp2蛋白是通过依赖ATP的解旋酶核心的构象变化来解旋双链。(3)本研究最终通过小角X-射线散射实验获得了全长Dbp2蛋白在溶液中的结构信息。由于Linker位置、N-和C-末端尾部的动态性,导致全长Dbp2蛋白在溶液中是动态变化的。(4)Dbp2的解旋酶核心几乎没有活性,而无序的N-和C-末端尾部赋予全长蛋白完整的解旋酶活性。此外,通过Dbp2蛋白末端Autoimmune dementia尾部和相邻核心结构域的荧光标记和单分子实验,揭示了Dbp2蛋白的N-和C-末端尾部重构RNA的分子机制,为Dbp2蛋白参与体内Dibutyryl-cAMP作用RNP重构提供了重要的生化基础。(5)Dbp2蛋白对不同构象的短loop的G4 DNA具有双重调节功能,即Dbp2能够促进折叠的G4结构进一步展开,而帮助G4序列进一步折叠。DDX5同样对不同构象的G4 DNA具有相反的调节活性,但与Dbp2蛋白相比,DDX5表现出很弱的G4序列折叠的活性,表明Dbp2蛋白可能参与了酿酒酵母基因组中短loop G4基序的构象调节。综上所述,本论文通过对酿酒酵母Dbp2蛋白的结构和功能的深入研究,为Dbp2蛋白参与细胞中的RNA结构调节和RNP重构提供了重要的生化基础。此外,我们获得的Dbp2解旋酶核心的晶体结构为DDX5相关癌症的小分子抑制剂的药物筛选提供了结构基础。