目的:1、明确糖尿病肾患者及糖尿病肾病小鼠肾组织的双特异性磷酸酶8(Dual-specificity phosphatase 8,DUSP8)表达和分布情况。2、明确高糖条件下DUSP8在足细胞损伤中的作用。方法:1、收集糖尿病肾病患者与对照组患者的肾组织:收集经肾穿刺活检确诊的糖尿病肾病患者的肾组织,和非糖尿病患者手术切除的癌旁的正常肾组织。通过DUSP8与足细胞标记物Synaptopodin的免疫荧光共染色,观察DUSP8在糖尿病肾病患者肾组织的表达水平与分布。2、构建糖尿病肾病小鼠模型并收集肾组织样本:(1)对糖尿病肾病小鼠和对照组小鼠的肾组织进行过碘酸雪夫染色(Periodicacid-schiff stain,PAS)和Masson染色,评估糖尿病肾病小鼠病理变化。(2)对糖尿病肾病小鼠和对照组小鼠的肾组织进行DUSP8与足细胞标记物Synaptopodin的免疫荧光共染色,观察DUSP8在糖尿病小鼠肾组织表达水平和分布情况。3、细胞培养:在5%CO2、95%饱和湿度、37℃的湿化培养箱中,用含10%FBS和1%青霉素-链霉素的RPMI1640培养基培养永生化人足细胞7天,以诱导selleck产品其分化,待足细胞分化成熟后,用于实验。4、将永生化人足细胞分为:低糖组(LG)、高糖组(HG)和高渗组(HO),分别用含低糖(5.5 mM葡萄糖)、高糖(30 mM葡萄糖)和高渗(5.5 mM葡萄糖+24.5 mM甘露醇)的RPMI 1640培养基培养48 h。(1)采用real time PCR和Western Blot检测足细胞中DUSP8的表达水平。(2)通过realtime PCR和Western Blot检测足细胞间充质蛋白Desmin和足细胞损伤标志蛋白ZO-1的表达水平。(3)通过Western Blot检测p-Drp1和MFN2的表达水平。5、构建DUSP8过表达质粒,并进一步将足细胞分为低糖组(LG)、高糖组(HG)、高糖+对照组(HG+OE-NC)、高糖+DUSP8过表达组(HG+OE-DUSP8):(1)采用real time PCR和Western Blot验证DUSP8质粒的过表达效率。(2)通过real time PCR和Western Blot检测Desmin、ZO-1的表达水平。(3)通过MitoSOX Red染色观察足细胞线粒体活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平的变化。(4)采用Mito-Tracker Red染色检测线粒体的形态变Hepatocyte nuclear factor化。(5)利用TMRE(Tetramethylrhodamine,ethyl ester)试剂盒检测线粒体膜通透性转换孔(Mitochondrial permeability transition pore,mPTP)开放和线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,ΔΨm)的耗散。6、构建DUSP8的小干扰RNA,并进一步将足细胞分为低糖组(LG)、高糖组(HG)、低糖+敲低对照组(LG+SI-NC)、低糖+DUSP8敲低组(LG+SI-DUSP8):(1)采用real time PCR和Western Blot检验DUSP8的敲低效率。(2)通过 real time PCR 和 Western Blot 检测 Desmin、ZO-1 的表达水平。(3)通过MitoSOX Red染色观察足细胞线粒体ROS水平。(4)采用Mito-Tracker Red染色检测线粒体的形态变化。(5)通过线粒体钙黄绿素(Calcein)荧光强度检测mPTP开放和Δψm耗散。结果:1、通过对糖尿病肾病患者与对照组的肾组织进行免疫荧光染色,我们发现DUSP8和足细胞标记物Synaptopodin在肾组织存在染色重叠。且在糖尿病肾病患者的肾组织中,DUSP8表达明显减少,伴随Synaptopodin表达下降,提示足细胞发生损伤时,DUSP8的表达水平明显降低。2、相比对照组小鼠,PAS染色和Masson染色显示糖尿病肾病小鼠的肾组织出现系膜细胞和基质增生,肾小球基底膜弥漫性增厚,以及肾小球硬化和纤维化。3、在糖尿病肾病小鼠的肾脏组织中,我们也发现DUSP8与足细胞标记物Synaptopodin有染色重叠,且表达水平呈现同步降低。4、与低糖组和高渗组相比,高糖组足细胞中DUSP8的表达水平显著下调(P<0.05),且DUSP8表达水平在高渗组和低糖组无统计学差异(P≥0.05);与低糖组和高渗组相比,高糖组足细胞Desmin、p-Drp1表达增多(P<0.05),ZO-1、MFN2表达减少(P<0.05)。5、我们构建了 DUSP8过表达质粒,并通过real timePCR和Western Blot验证其表达效率(P<0.05)。且进一步证实,与高糖组相比,DUSP8过表达减轻了高糖刺激诱导的Desmin的表达增多和ZO-1的表达减少(P<0.05)。同时,我们通过Mito-Tracker Red染色、MitoSOX Red染色以及TMRE染色发现,高糖刺激导致棒状线粒体减少、点状线粒体增加、线粒体网状结构破坏、线粒体ROS生成增加、线粒体膜电位下降以及膜通透性转换孔的开放,而DUSP8过表达可逆转上述改变。6、我们构建了 DUSP8的小干扰RNA,并通过real time PCR和Western Blot验证了 DUSP8 siRNA敲低效率(P<0.05)。且进一步证实,与低糖组相比,敲低DUSP8可导致Desmin表达增多与ZO-1表达减少,差异具有统计学意义(P<0.05);MitoSOXRed染色、Mito-Tracker Red染色和钙黄绿素染色显示,与低糖组相比,敲低DUSP8导致棒状线粒体减少、点状线E7080分子式粒体增加、线粒体网状结构破坏、线粒体ROS生成增加、线粒体膜电位下降和膜通透性转换孔的开放。结论:DUSP8在糖尿病肾病患者和糖尿病肾病小鼠的肾脏组织以及高糖诱导的足细胞中表达减少,且DUSP8可调控高糖诱导的足细胞损伤和线粒体紊乱的发生,提示DUSP8在糖尿病肾病的发生和发展中发挥作用。DUSP8有望成为糖尿病肾病诊断和治疗的新靶点。目的:明确DUSP8能否通过调控JNK磷酸化水平参与高糖诱导的线粒体异常和足细胞损伤。方法:1、按照实验要求,将永生化人足细胞分为低糖组(LG)、高糖组(HG)和高渗组(HO),分别在低糖(5.5mM葡萄糖)、高糖(30mM葡萄糖)和高渗(5.5 mM葡萄糖+24.5 mM甘露醇)条件下培养48 h。通过Western Blot检测JNK磷酸化水平。2、转染DUSP8的过表达质粒,同时应用JNK激活剂茴香霉素(Anisomycin,Ani)促进JNK的磷酸化激活。将足细胞分为低糖组(LG),高糖组(HG),高糖+DUSP8过表达组(HG+OE-DUSP8),以及高糖+DUSP8过表达+茴香霉素组(HG+OE-DUSP8+Ani):(1)利用Western Blot检测JNK磷酸化水平,验证茴香霉素对JNK磷酸化激活的作用。(2)采用real time PCR和Western Blot检测Desmin、ZO-1的表达水平的变化。(3)通过Mito-Tracker Red染色观察线粒体的形态变化。(4)通过MitoSOX Red染色检测足细胞线粒体ROS水平。结果:1、Western Blot显示,与低糖组和高渗组相比,高糖组足细胞的JNK磷酸化水平显著升高(P<0.05),而JNK磷酸化水平在高渗组和低糖组均无统计学差异(P≥0.05)。2、Western Blot显示,与高糖组相比,高糖条件下足细胞转染DUSP8过表达质粒可显著降低高糖刺激诱导的JNK磷酸化(P<0.05);而与高糖组+DUSP8过表达组相比,在足细胞转染DUSP8过表达质粒后加入茴香霉素,可以显著抑制JNK磷酸化水平的降低(P<0.05)。且real time PCR和Western Blot显示,与高糖组相比,高糖条件下转染DUSP8过表达质粒,可显著抑制高糖刺激诱导的Desmin的表达增加和ZO-1的表达减少(P<0.05);与高糖+DUSP8过表达组相比,高糖+DUSP8过表达+茴香霉素组Desmin表达显著增加、ZO-1的表达显著减少(P<0.05),茴香霉素可在一定程度上阻断DUSP8对高糖条件下足细胞的保护作用。3、Mito-Tracker Red染色和MitoSOX Red染色显示,与高糖组相比,高糖条件下足细胞转染DUSP8过表达质粒,可减轻高糖诱导的棒状线粒体减少、点状线粒体增加、线粒体网状结构破坏和线粒体ROS生成的增加;而与高糖组+DUSP8过表达组相比,在高糖条件下足细胞转染DUSP8过表达质粒后加入茴香霉素,可在一定程度上阻断DUSP8对高糖条件下足细胞线粒体的保护作用。结论:高糖刺激可导致足细胞JNK的磷酸化水平增高,而DUSP8可通过抑制JNK磷酸化,保护足细胞免受高糖诱导的线粒体功能紊乱,进而保护足细胞功能。