栽培草莓(Fragaria × ananassa Duch.)是蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)多年生宿根草本植物,其果实小而经济价值较高,具有营养、医疗和保健等功能,是一种重要的世界园艺作物,Vc含量尤其丰富有“水果皇后”的美誉。因其商业价值显著并具有一定的健康效益为世界各地的生产者和消费者所喜爱。草莓果实已被证明具有高抗氧化活性,CH-223191作用这与酚类化合物的含量,特别是花青苷的含量呈正相关,主要受类黄酮合成途径的影响。花青苷属于类黄酮化合物,是天然的水溶性色素,是果实蔬菜等呈现颜色的主要色素成分,其作为重要的次生代谢产物,在植物生长发此网站育的各个过程起着关键作用。本试验采用生物信息学方法对栽培草莓MYB转录因子进行基因家族分析,结合不同品种草莓(“红颜”、“桃熏”、“白雪公主”)果实以及“桃熏”果实不同时期表达谱进行联合分析,挖掘出与果实品质相关的系列候选基因。通过文献调研进一步确定本研究的目的基因FaMYB44.1及FaMYB44.3,对其进行分子克隆、转录激活、VIGS瞬时转化“红颜”草莓、原核表达等相关实验分析,明确FaMYB44.1为调控草莓果实花青苷合成关键基因,通过EMSA和双荧光素酶实验进一步完善FaMYB44.1介导草莓果实花青素合成的调控网络,旨在揭示FaMYB44.1转录因子在草莓花青苷合成途径中的作用以及在转录水平上对草莓代谢途径以及对果实品质的调控功能,为草莓花青苷合成调控提供理论基础,对改善草莓果实品质以及其他园艺作物的遗传改良具有重要的意义。我们以草莓果实为研究材料,进行FaMYB44.1及FaMYB44.3基因的功能鉴定。主要研究结果如下:(1)对FaMYB进行了基因家族分析,从中筛选关键MYB候选基因。在F ananassa全基因组范围内,共鉴定了 407个MYB基因(FaMYB),并根据亚基因组位置进行了命名。根据系统发育分析,407个FaMYB被分为36个亚组。根据同源性分析结果表明,全基因组重复和节段重复是FaMYBs基因家族扩张的主要原因。同源染色体上的同源基因组共鉴定出101个具有1-6个等位基因的FaMYB基因座。具有不同果实品质和果实成熟过程的三个品种(“红颜”、“白雪公主”、“桃熏”)的差异表达图谱提供了参与果实品质调控的8个候选基因座。在本实验中,共筛选出7/5/4个FaMYBs分别作为参与花青苷生物合成、糖和有机酸以及果实香气相关的候选基因。这些结果为进一步分析草莓果实品质的基因调控提供了关键的FaMYBs。选择mrna26289和mrna24027两个基因座作为本研究的候选基因,相同基因座的基因序列同源率极高,在不同品种草莓以及“桃熏”不同时期的转录组分析中都展现了较高的表达丰度,这两个基因经BLAST并结合前人研究,分别将其命名为FaMYB44.1及FaMYB44.3。(2)基因的克隆及表达分析。根据草莓FaMYB44.1及FaMYB44.3及其它物种中的MYB44的氨基酸序列构建了系统发育进化树。结果显示,草莓FaMYB44.1和白梨(Pyrus bretschneideri)中的PbMYB44有很高的同源性,草莓FaMYB44.3和月季(Rosa chinensis)中的RcMYB44有很高的同源性。结构功能域分析表明,FaMYB44.1及FaMYB44.3具有典型的MPCR EquipmentYB结合结构域。成功克隆了FaMYB44.1及FaMYB44.3的CDS全长编码序列。组织特异性结果分析可知FaMYB44.1和FaMYB44.3在果实发育前期基因表达丰度较高,果实成熟后期表达水平较低,可能与果实花青苷积累过程负相关。亚细胞定位及自激活实验结果表明两者均为核定位并具有自激活活性的转录因子,进一步筛选到了合适的5 mM 3-AT抑制浓度。(3)FaMYB44.1参与草莓花青苷合成积累过程。利用VIGS病毒载体瞬时沉默草莓果实中的FaMYB44.1和FaMYB44.3基因表达,结果显示沉默FaMYB44.1基因表达后草莓果实着色加快,花青苷积累增多,而沉默FaMYB44.3基因表达后草莓果实着色变化不明显。结果表明FaMYB44.1影响草莓果实花青苷积累,而FaMYB44.3对草莓果实花青苷积累的影响不明显。(4)利用EMSA凝胶阻滞、双荧光素酶以及共注射草莓果实实验证实FaMYB44.1转录因子特异性结合FaF3H启动子,转录抑制其表达,最终影响了草莓果实中花青苷的合成积累。EMSA结合筛选实验结果表明,FaMYB44.1特异性结合FaF3H基因启动子上的MBS CAACTG-motif元件,而FaMYB44.3与筛选的结构基因没有结合条带;双荧光素酶实验证实FaMYB44.1转录抑制FaF3H基因的表达;共注射草莓果实实验证实FaMYB44.1转录因子通过转录抑制下游花青苷关键基因FaF3H表达最终影响了草莓果实中的花青苷生物合成。