研究背景动脉粥样硬化是导致冠心病、心力衰竭等心血管疾病的主要原因。目前认为脂质代谢异常诱导的血管内皮损伤是导致动脉粥样硬化形成的关键因素,在动脉粥样硬化形成过程中血管内皮是最先受到损伤的部位。由此,靶向保护血管内皮细胞进而减轻动脉粥样硬化机制的相关研究引起了人们的关注。近年来研究发现,成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)、FGF5等生长因子通过抑制细胞凋亡和炎症等途径来减轻内皮细胞损伤,生长因子被认为是调节内皮细胞稳态的主要因子。表明生长因子可能为进一步阐明动脉粥样硬化的发生发展机制提供了新思路。FGF21被认为是一种与细胞损伤相关的生长因子,目前已证实寒冷、禁食/饥饿和某些病理条件刺激后可以引起其水平升高,然而FGF21水平升高的作用及其机制等仍存在争论。有研究发现,冠心病患者血清中FGF21水平升高与未来发生心血管不良事件风险存在着关联性;过表达FGF21促进肌肉萎缩、骨质流失。与此相反,有实验发现,外源性FGF21可以通过抑制内皮细胞焦亡从而减轻内皮损伤;还有研究证实外源性FGF21通过促进脂联素分泌、抑制胆固醇合成和促进胆固醇排出改善脂质代谢紊乱,也可以通过增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平、降低丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平抑制氧化应激,进而延缓动脉粥样硬化的进展。但是,FGF21与血管内皮细胞损伤的关系尚不十分清楚。因此,需要进一步探讨FGF21对脂质代谢异常诱导的内皮细胞损伤介导的动脉粥样硬化的影响。铁死亡是一种铁依赖的、脂质过氧化驱动的死亡方式,其发生是细胞内脂质活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成与降解的平衡失调所致。动脉粥样硬化主要特征是脂质代谢紊乱,血液中增多的低密度脂蛋白胆固醇进入血管内皮下,被氧化修饰后生成氧化型低密度脂蛋白胆固醇(oxidized low density lipoprotein cholesterol,ox LDL-C),进而加重内皮细胞损伤,提示铁死亡可能参与动脉粥样硬化形成过程中血管内皮细胞损伤。最近也有研究发现,抑制铁死亡可以减轻脂质代谢异常引起的内皮细胞损伤。此外,在铁死亡发生过程中,Fe~(2+)和H_2O_2反应会生成具有强氧化能力的羟自由基和Fe~(3+),Fe~(3+)又被过氧化物(O~(2-))进一步还原成Fe~(2+),重新与H_2O_2反应,这个循环中会大量生成羟基自由基,是产生ROS较强的反应之一。在糖尿病心肌病中发现,铁死亡抑制剂较凋亡抑制剂、坏死抑制剂能够更好地减轻心肌损伤,表明铁死亡在ox-LDL诱导的内皮细胞损伤中的作用可能更为关键。还有研究发现,过表达FGF21或重组FGF21蛋白能够抑制铁死亡减轻肝细胞损伤和纤维化。研究FGF21对血管内皮细胞铁死亡的影响能够进一步阐释FGF21对血管内皮细胞损伤导致的动脉粥样硬化的作用机制。研究认为FGF21与其受体FGFR1结合后激活肝激酶B1,促使AMPKα亚基的172位点磷酸化。已有研究证实AMP依赖的蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)激活后通过提高谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的表达,进而抑制脂质代谢紊乱引起的巨噬细胞铁死亡。此外,AMPK还可以激活核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2),促进其核易位。NRF2是转录激活因子,在抗氧化反应中发挥重要的作用。NRF2的激活可以提高GPX4和铁蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH)的表达,通过抑制脂质过氧化物的产生和蓄积,进而减轻心肌损伤。已有研究证实AMPK/NRF2途径调控的相关蛋白被认为是铁死亡的关键分子。这些发现表明FGF21可能通过AMPK/NRF2信号通路抑制脂质代谢异常诱导的血管内皮细胞铁死亡。本研究以FGF21为切入点,结合体内和体外实验,探讨FGF21是否通过AMsystems medicinePK/NRF2信号通路抑制脂质代谢异常诱导的内皮细胞铁死亡,为FGF21在动脉粥样硬化形成中的治疗应用提供了理论依据。研究方法1.分析FGF21在内皮细胞损伤和动脉粥样硬化形成中的表达变化。(1)收集冠心病患者血清,应用Elisa试剂盒检测FGF21在冠心病患者血清中的含量。(2)高脂饲料喂养Apo E~(-/-)小鼠12周构建动脉粥样硬化模型,利用western blot和Elisa试剂盒分别检测高脂饮食的Apo E~(-/-)小鼠动脉粥样硬化组织及血清中FGF21的含量。(3)应用150μg/m L的ox-LDL处理人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)24小时构建内皮细胞损伤模型,利用western blot检测ox-LDL诱导的内皮细胞损伤中FGF21的表达变化。2.明确FGF21对ox-LDL诱导的内皮细胞损伤和高脂饮食诱导的动脉粥样硬化的影响。(1)使用ox-LDL处理慢病毒转染后的高低表达FGF21内皮细胞,利用CCK-8试剂盒检测细胞活力,LDH试剂盒检测LDH释放量以及基质胶小管实验检测内皮细胞血管生成能力,明确FGF21对ox-LDL诱导的内皮细胞损伤的影响。(2)探究FGF21减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤是在细胞内还是通过分泌到细胞外来发挥其保护作用。我们首先利用蛋白转运抑制剂莫能菌素(5μM)预处理过表达FGF21内皮细胞6 h,再联合ox-LDL共同处理24 h,通过检测细胞活力、LDH释放量和血管生成能力的变化,评估FGF21在细胞内的作用。其次,我们利用200 ng/m L的重组FGF21蛋白预处理内皮细胞6 h,再联合ox-LDL共同处理24 h,重复上述实验,评估外源性FGF21的作用。(3)高脂饮食的Apo E~(-/-)小鼠腹腔注射重组FGF21蛋白(0.1 mg/kg/day),利用油红O染色和HE染色检测主动脉斑块面积,生化试剂盒检测血脂变化,分析外源性FGF21能否减轻动脉粥样硬化病变。3.探讨FGF21是否通过调控铁死亡减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤和改善动脉粥样硬化。(1)在小鼠动脉粥样硬化模型中,应用铁检测试剂盒检测主动脉组织中亚铁离子水平,MDA和GSH试剂盒检测脂质过氧化水平,western blot检测铁死亡相关蛋白ACSL4、GPX4、FTH和HO-1的表达变化,免疫荧光染色检测血管内皮细胞中GPX4的表达变化,分析高脂饮食能否引起血管内皮细胞铁死亡。(2)在内皮细胞损伤模型中,通过检测ROS、线粒体膜电位、亚铁离子、脂质过氧化水平和铁死亡相关蛋白的表达变化,探究ox-LDL是否引起内皮细胞铁死亡。(3)ox-LDL处理高低表达FGF21的内皮细胞,通过检测铁死亡相关指标的表达变化,综合评估FGF21对ox-LDL诱导的内皮细胞铁死亡的调控作用。(4)为了探讨FGF21是在细胞内还是通过分泌到细胞外来调控铁死亡,我们首先利用蛋白转运抑制剂莫能菌素预处理过表达FGF21内皮细胞,通过检测铁死亡相关指标的表达变化,分析FGF21在细胞内能否抑制ox-LDL诱导的内皮细胞铁死亡。其次,重组FGF21蛋白预处理内皮细胞,重复上述实验,探究外源性FGF21是否调控ox-LDL诱导的内皮细胞铁死亡。(5)高脂饮食的Apo E~(-/-)小鼠腹腔注射重组FGF21蛋白,通过检测铁死亡相关指标的表达变化,探究外源性FGF21对小鼠血管内皮细胞铁死亡的影响。4.基于AMPK/NRF2信号通路阐明FGF21调控ox-LDL诱导的内皮细胞铁死亡的机制。(1)Western blot检测ox-LDL处理的内皮细胞和小鼠动脉粥样硬化组织中AMPK/NRF2的表达变化。(2)Western blot检测重组FGF21蛋白联合ox-LDL处理的内皮细胞,腹腔注射重组FGF21蛋白的小鼠主动脉组织中AMPK/NRF2的表达变化,明确外源性FGF21对AMPK/NRF2表达的影响。(3)在重组FGF21蛋白预处理的内皮细胞中,应用AMPK抑制剂(Compound C,10μM)预处理内皮细胞6 h,再联合ox-LDL共同处理24 h,通过检测细胞活力和铁死亡相关指标的表达变化,探究AMPK/NRF2信号通路在外源性FGF21抑制ox-LDL诱导的内皮细胞铁死亡中的作用。研究结果1.FGF21在冠心病患者血清、小鼠动粥样硬化组织和血清、以及ox-LDL诱导的内皮细胞损伤中表达升高。2.FGF21减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤并抑制高脂饮食诱导的动脉粥样硬化形成。(1)与ox-LDL处理组相比,过表达FGF21提高ox-LDL处理后的细胞活力、降低LDH释放量、提高血管生成能力,低表达FGF21对细胞活力、LDH释放量和血管生成能力的影响与前述相反,表明FGF21减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤。(2)与过表达FGF21+ox-LDL组相比,抑制过表达FGF21内皮细胞分泌蛋白后,细胞活力下降、LDH释放增多、血管生成能力下降;而与ox-LDL组相比,重组FGF21蛋白干预组细胞活力升高、LDH释放量降低、血管生成能力升高,提示FGF21主要通过分泌到细胞外来减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤。(3)油红O染色和HE染色结果显示,重组FGF21蛋白干预组小鼠主动脉斑块面积比高脂饮食组减小;血脂检测结果显示,相较于高脂饮食组,重组FGF21蛋白干预组小鼠血清中甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量降低,而高密度脂蛋白胆固醇含量升高,表明外源性FGF21减小主动脉斑块面积并改善血脂异常。3.FGF21通过抑制铁死亡减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤并缓解动脉粥样硬化病变。(1)与对照组相比,高脂饮食引LBH589 MW起小鼠主动脉组织中亚铁离子升高,脂质过氧化水平升高,铁死亡相关蛋白ACSL4和HO-1的表达升高、GPX4和FTH的表达降低,与血管内皮细胞标志蛋白CD31共染的GPX4表达降低,表明高脂饮食能够诱导血管内皮细胞铁死亡。(2)与对照组相比,ox-LDL处理内皮细胞后,细胞内ROS水平升高,线粒体膜电位降低,亚铁离子水平升高,MDA水平升高,GSH水平降低,ACSL4和HO-1的表达升高、GPX4和FTH的表达降低,表明ox-LDL能够诱导内皮细胞铁死亡。(3)与ox-LDL处理组相比,过表达FGF21改善ox-LDL处理后的内皮细胞线粒体结构,降低细胞内ROS、亚铁离子和MDA水平,提高GSH水平,降低ACSL4和HO-1的表达,提高FTH和GPX4的表达;低表达FGF21对内皮细胞铁死亡的影响与前述相反,提示FGF21抑制ox-LDL诱导的内皮细胞铁死亡。(4)与过表达FGF21+ox-LDL相比,抑制过表达FGF21内皮细胞分泌蛋白后,内皮细胞线粒体嵴减少,细胞内ROS、亚铁离子和MDA水平升高,GSH水平降低,ACSL4和HO-1的表达升高,FTH和GPX4的表达降低,表明抑制过表达FGF21内皮细胞分泌蛋白后,FGF21对铁死亡的抑制作用明显减弱。然而,与ox-LDL处理组相比,重组FGF21蛋白干预组内皮细胞线粒体结构得到改善,细胞内ROS、亚铁离子和MDA水平降低,GSH水平升高,ACSL4和HO-1的表达降低、FTH和GPX4的表达升高,表明FGF21主要通过分泌到细胞外来抑制内皮细胞铁死亡。(5)与高脂饮食组相比,重组FGF21蛋白干预组小鼠主动脉组织中亚铁离子和MDA水平降低,GSH水平升高,ACSL4和HO-1的表达降低,FTH和GPX4的表达升高,与血管内皮细胞标志蛋白CD31共染的GPX4表达升高,表明外源性FGF21通过抑制血管内皮细胞铁死亡来改善小鼠动脉粥样硬化形成。4.重组FGF21蛋白通过激活AMPK/NRF2信号通路抑制ox-LDL诱导的内皮细胞铁死亡。(1)与对照组相比,内皮细胞损伤组和高脂饮食组中磷酸化AMPK的表达降低,核蛋白NRF2的表达升高。(2)与内皮细胞损伤组和高脂饮食组相比,外源性FGF21增加内皮细胞损伤和动脉粥样硬化组织中AMPK的磷酸化水平,并进一步提高核蛋白NRF2的表达。(3)与重组FGF21蛋白+ox-LDL组相比,抑制AMPK后,细胞活力下降、线粒体膜电位下降、MDA水平升高、GSH水平下降,ACSL4和HO-1的表达升高、FTH和GPX4的表达降低,以上结果表明,外源性FGF21通过激活AMPK/NRF2信号通路抑制内皮细胞铁死亡。结论1.临床患者血清中、小鼠血清和主动脉组织中以及细胞中内源性FGF21水平升高与ox-LDL诱导的内皮细胞损伤介导的动脉粥样硬化有关。2.通过检测ox-LDL处理内皮细胞后的细胞活力、LDH释放量和血管生成能力,结合高脂饮食的Apo E~(-/-)小鼠主动脉斑块面积和血脂变化,发现过表达FGF21能够减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤,低表达FGF21加重内皮细胞损伤;使用莫能菌素抑制蛋白分泌后,过表达FGF21减轻内皮细胞损伤的作用明显减弱;而重组FGF21蛋白能够显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞损伤,提示FGF21主要通过自分泌方式减轻ox-LDL诱导的内皮细胞损伤以及缓解动脉粥样硬化病变。3.依据ROS、亚铁离子、MDA和GSH水平,ACSL4、GPX4、FTH及HO-1的表达等铁死亡相关指标,表明外源性FGF21抑制ox-LDL诱导的Erdafitinib生产商内皮细胞损伤和动脉粥样硬化形成作用可能与铁死亡有关。4.外源性FGF21激活AMPK/NRF2信号通路抑制了铁死亡是减轻脂质代谢异常诱导的内皮细胞损伤导致的动脉粥样硬化的主要机制之一。