研究背景与目的肝癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤,病死率高,极大地威胁着人类的生命健康。而中国是世界上乙肝病毒携带者最多的国家,因此成为原发性肝癌患者最多的国家,肝癌患者数约占每selleck NMR年全球新发肝癌患者的50%,其死亡率也位居全球第三位。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)具有起病隐匿、进展快、复发早、易耐药和预后差的临床特点。HCC的治疗以放疗、化疗、介入、微创和靶向药物等综合治疗为主,其中靶向治疗药物索拉菲尼因快速耐药的产生严重影响疗效。而一线化疗药物的疗效也因多药耐药的产生而受到严重的影响。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是临床常用的HCC化疗药物之一,可以有效的杀灭或抑制肝癌细胞的生长,但其长期应用可诱导癌细胞产生耐药性,导致其治疗效果不佳。与正常组织相比,癌细胞存在大量的代谢异常,且不同肿瘤之间、不同癌症的发展阶段都存在代biomimetic transformation谢特异性,尤其是癌症进展后期因治疗耐药性会出现新的代谢表型依赖性。针对于癌细胞耐药后出现的适应性代谢特点,我们拟研究代谢重编程与5-FU耐药的肝癌细胞之间的相关性。谷氨酰胺作为机体中含量最丰富的氨基酸,在生物体内参与多个代谢途径,包括三羧酸循环、核苷酸生物合成途径、非必需氨基酸合成途径、维持氧化还原平衡状态等。与正常组织相比,癌细胞消耗谷氨酰胺的速率超过谷氨酰胺生物合成的速率。因此,谷氨酰胺的代谢重编程在肿瘤的恶性进展中发挥重要的作用。谷氨酰胺酶(Glutaminase,GLS)作为谷氨酰胺代谢途径中限速酶,可将谷氨酰胺转化为谷氨酸,后者转化成α-酮戊二酸参与调控其他代谢通路。根据TCGA数据库显示,与正常组织相比,GLS通常在肿瘤组织中具有更高的表达水平和活性,例如胃腺癌、肝细胞癌和结肠腺癌等。基于癌症特征分析工具显示,GLS在癌症中的功能与细胞能量学、氧化还原稳态、维持增殖信号传导、诱导凋亡、驱动肿瘤进展、侵袭和转移以及不良预后相关。为了解决肝癌细胞因耐药导致患者治疗效果不佳的问题,本研究分析了耐药肝癌细胞的代谢特点,从肿瘤代谢重编程出发解决常规化疗药物5-FU应用于临床肝癌患者后出现耐药性的问题,以期提高抗肿瘤药物的化疗效果,为促进临床合理用药提供实验依据和理论支持。实验方法和结果1.MTT法检测Bel7402/5FUCL13900纯度细胞的耐药性以及耐药倍数,实验结果显示5-FU作用于细胞48 h和72 h后耐药倍数分别为98.14倍和66.08倍。2.MTT法和克隆形成实验检测Bel7402细胞和Bel7402/5FU细胞对谷氨酰胺依赖性差异,结果发现耐药后细胞对谷氨酰胺依赖性显著增加。3.使用还原性谷胱甘肽(Glutathion,GSH)含量检测试剂盒检测Bel7402和Bel7402/5FU细胞中的GSH水平,实验结果显示与Bel7402细胞相比,Bel7402/5FU细胞中GSH水平明显上升,在缺乏谷氨酰胺条件下Bel7402/5FU细胞的GSH水平下降。4.使用DCFH-DA染色法检测Bel7402细胞和Bel7402/5FU细胞中ROS水平,发现耐药细胞的ROS水平升高,在缺乏谷氨酰胺条件下Bel7402/5FU细胞的ROS水平进一步上升。5.探究Bel7402细胞耐药后支持氧化还原水平发生变化的因素,实验结果显示Bel7402/5FU细胞中G6PD蛋白表达水平下降,说明产生的NADPH磷酸戊糖途径减弱,这导致了细胞耐药后氧化还原水平发生变化。6.TCGA数据库分析GLS在癌症中的功能以及与肿瘤预后的相关性,发现GLS高表达与不良预后相关。7.使用GLS活性检测试剂盒检测Bel7402细胞和Bel7402/5FU细胞中GLS活性差异,实验结果显示Bel7402/5FU细胞中GLS活性明显高于Bel7402细胞。8.MTT法检测谷氨酰胺酶抑制剂CB-839对Bel7402细胞和Bel7402/5FU细胞的抗增殖作用,结果发现CB-839对Bel7402/5FU细胞的抗增殖作用更强。9.使用Gln检测试剂盒检测使用GLS抑制剂CB-839后细胞内谷氨酸水平的变化,实验结果显示使用CB-839显著降低了 Bel7402/5FU细胞内谷氨酸水平,说明GLS活性受到了抑制。10.MTT法检测GLS抑制剂CB-839和5-FU联合应用对Bel7402/5FU细胞产生的抗增殖效果,结果显示二者存在协同抗增殖作用。11.细胞划痕实验、Transwell实验检测CB-839和5-FU联合应用对Bel7402/5FU细胞侵袭、迁移能力的影响,实验结果证明二者联用能够抑制Bel7402/5FU细胞侵袭、迁移能力,并且抑制侵袭、迁移相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达。12.使用流式细胞仪检测CB-839和5-FU联合应用对Bel7402/5FU细胞周期分布的影响;实验结果显示二者联合应用使Bel7402/5FU细胞周期阻滞在S期和G2期并影响周期相关蛋白CDK1、Cyclin B1和Cyclin A2的表达。13.Western blot实验检测CB-839和5-FU联合应用是否影响PI3K/Akt/mTOR信号通路,实验结果显示二者联合应用后PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达降低。14.采用吖啶橙染色实验、Annexin V-FITC/PI双染实验以及Hoechst 33342染色实验检测CB-839和5-FU联合应用对Bel7402/5FU细胞凋亡和自噬的影响,实验结果证明二者联合应用对Bel7402/5FU细胞凋亡和自噬无明显影响。15.采用GSH检测试剂盒检测Bel7402/5FU细胞在使用5-FU和CB-839后GSH水平,实验结果证明单用5-FU使细胞内GSH水平上升以应对5-FU造成的ROS水平升高,单用CB-839由于抑制了谷氨酰胺代谢,使GSH的水平减少,二者合用抑制了 5-FU造成的GSH水平的升高,从而促进了 5-FU对细胞造成的氧化应激。16.使用DCFH-DA染色法检测CB-839和5-FU联合应用对Bel7402/5FU细胞中ROS水平的影响,实验结果显示使用5-FU或CB-839后细胞中ROS水平有不同程度的上升,二者合用后细胞中的ROS水平进一步显著上升。17.使用铁离子检测试剂盒和MDA检测试剂盒检测CB-839和5-FU联合应用对Bel7402/5FU细胞中铁离子和MDA水平的影响以及Nrf2-HO-1-GPX4通路蛋白水平的变化。实验结果显示二者联用后,Bel7402/5FU细胞中铁离子水平和MDA水平明显升高,并且Nrf2-HO-1-GPX4通路的蛋白水平下降,证明其死亡方式与铁死亡相关。18.采用动物体内实验检测CB-839联合5-FU对裸鼠Bel7402/5FU移植瘤的生长抑制作用。实验结果显示CB-839和5-FU合用可以显著抑制移植瘤的生长。另外,除合用组外,其他三组裸鼠出现不同程度的肝转移。这提示我们CB-839和5-FU联合应用在一定程度上可以抑制肝癌的转移。Western blot实验检测各组铁死亡相关蛋白GPX4和HO-1的表达变化,采用免疫组化检测GPX4的表达。实验结果发现合用组GPX4和HO-1的表达显著下降。以上实验结果说明CB-839和5-FU联合应用通过促进癌细胞铁死亡有效抑制肿瘤的发生发展。实验结论论文研究发现,肝癌细胞Bel7402/5FU的谷氨酰胺代谢依赖性发生改变,对谷氨酰胺的依赖性显著增强;Bel7402/5FU细胞内谷氨酰胺酶过度活化,谷胱甘肽合成增多,细胞内ROS水平也升高。利用GLS抑制剂CB-839与5-FU联合应用可以协同抑制细胞的增殖、侵袭、迁移并造成周期阻滞,但并不诱导细胞凋亡和自噬。另外,二者合用能够破坏Bel7402/5FU细胞氧化还原稳态,降低细胞内谷胱甘肽水平使其ROS水平上升,造成细胞内氧化应激,同时Fe2+水平和MDA水平上升,诱导细胞发生铁死亡,从而抑制癌症的恶性进展。研究意义本论文探究了肝癌细胞Bel7402在发生耐药后,细胞内发生了谷氨酰胺代谢重编程和ROS水平变化。因此,GLS抑制剂对Bel7402/5FU细胞有较强的杀伤性和靶向性,与5-FU联合应用在体外具有较好的抗增殖、侵袭、迁移和促进细胞铁死亡的作用。本论文旨在从耐药细胞的新的适应性代谢特点出发,提出特异性靶向耐药癌细胞的有效的治疗手段,从而为临床耐药患者提供更好的治疗方案和新的治疗思路。