背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤疾病之一。近年来,中国女性乳腺癌死亡率逐年攀升,其中大部分乳腺癌患者为雌激素受体(Estrogen receptor,ER)阳性,严重影响我国女性生命健康。越来越多的研究表明,肿瘤细胞上表达人类白细胞抗defensive symbiois原G(human leukocyte antigen-G,HLA-G)分子,HLA-G作为免疫抑制分子可阻碍免疫反应发生,促进肿瘤细胞逃避免疫监视。研究发现,血小板作为外周血液中最小的无核细胞,除了具有被公认的止凝血功能之外,活化后的血小板保护乳腺癌细胞免受免疫系统清除,不断诱导肿瘤免疫微环境的建立,对乳腺癌细胞生物学功能产生重要影响。以上研究说明,HLA-G与血小板对乳腺癌疾病的发生发展有关键作用,但LEE011是在HLA-G调控下血小板对乳腺癌细胞增殖、凋亡等常见生物学行为方面的影响目前研究甚少。因此,进一步探讨HLA-G是否协同血小板影响ER阳性乳腺癌细胞的发生发展,将为临床寻找ER阳性乳腺癌免疫治疗靶点提供理论依据。目的观察血小板对ER阳性乳腺癌细胞MCF-7、T47D上HLA-G表达的影响,然后采用si RNA技术敲低细胞上的HLA-G,进而探讨HLA-G是否协同血小板影响乳腺癌细胞的增殖凋亡。方法1.建立PRP/PPP与乳腺癌细胞共培养模型:采集健康人EDTA-K_2抗凝血液,通过不同离心力分离出血小板,制备富血小板血浆(PRP)和乏血小板血浆(PPP),然后制备成10%PPP、10%PRP1(低浓度血小板)及10%PRP2(高浓度血小板)培养基,从而替代10%胎牛血清培养基培养乳腺癌细胞MCF-7和T47D。2.检测血小板对乳腺癌细胞表达HLA-G的影响:使用10%PPP、10%PRP1及10%PRP2培养基分别培养MCF-7和T47D细胞,通过实时荧光定量PCR、免疫印迹试验检测乳腺癌细胞的HLA-G m RNA和HLA-G蛋白,分析血小板对乳腺癌细胞表达HLA-G的影响Alisertib。3.沉默HLA-G调控血小板影响乳腺癌细胞的生物学行为:利用si RNA技术合成4组si RNA-HLA-G,通过实时荧光定量PCR技术筛选出一个沉默效果最好的si RNA-HLA-G。实验分为4组,分别采用10%PPP和10%PRP培养基培养MCF-7和T47D细胞,即PPP对照组(PPP NC)、PRP对照组(PRP NC)、PPP沉默HLA-G组(PPP si RNA)及PRP沉默HLA-G组(PRP si RNA)。通过流式细胞术检测HLA-G沉默后血小板对MCF-7、T47D细胞凋亡的影响;通过实时荧光定量PCR检测HLA-G沉默后血小板对MCF-7、T47D细胞表达上皮-间质转化(EMT)标志物(E-cadherin、Fibranecti-n、N-cadherin、Snail、Vimentin、ZEB-1和β-catenin)的影响。4.沉默HLA-G调控血小板影响乳腺癌细胞的肿瘤微环境:针对上述4组细胞,通过实时荧光定量PCR检测HLA-G沉默后血小板对MCF-7、T47D细胞表达炎性细胞因子(TNF-α、i NOS)、趋化因子(CCL2、CCL5)的影响。结果1.血小板促进乳腺癌细胞表达HLA-G使用含有不同浓度血小板的培养基培养MCF-7和T47D细胞,发现随着血小板浓度的增高,MCF-7和T47D细胞均呈现HLA-G m RNA和HLA-G蛋白表达增强。2.沉默HLA-G调控血小板影响乳腺癌细胞的生物学行为筛选出沉默效果最佳的si RNA,即si(595)-HLA-G,并与si RNA-control(对照)分别转染至MCF-7和T47D细胞,分析HLA-G及血小板对ER阳性乳腺癌细胞的增殖、凋亡及EMT转化能力的影响,发现MCF-7和T47D细胞均表现出血小板促进ER阳性乳腺癌细胞增殖、抑制凋亡和促进EMT转化,在MCF-7和T47D细胞中继续转染si(595)-HLA-G后,乳腺癌细胞的增殖能力明显减弱、凋亡能力明显增强和EMT转化能力显著减弱(E-cadherin表达升高,Fibranectin、N-cadherin、Snail、Vimentin、ZEB-1、β-catenin表达降低)。3.沉默HLA-G减弱血小板对肿瘤微环境形成的影响分别使用10%PPP、10%PRP培养基培养ER阳性乳腺癌细胞(MCF-7、T47D),进而将si(595)-HLA-G(si RNA-control为对照)转染MCF-7、T47D细胞中,对比分析PPP NC、PRP NC、PPP si RNA及PRP si RNA共4组细胞中炎性细胞因子、趋化因子的m RNA表达差异,结果显示,血小板促进炎性细胞因子(TNF-α、i NOS)、趋化因子(CCL2、CCL5)表达,沉默HLA-G后可以有效减弱炎性细胞因子和趋化因子的表达。结论血小板能够诱导HLA-G促进ER阳性乳腺癌细胞增殖和EMT转化,影响肿瘤微环境形成,对ER阳性乳腺癌的发生发展发挥重要作用。