胃癌因其发病率高、恶性程度高、确诊时期晚等特点,成为世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。针对胃癌的治疗按照不同分型分期,应用手术、化疗、放疗以及辅助治疗等方案相互结合进行,其中化疗则是重要的一项治疗手段。但随着化疗药物使用次数增多以及患者的个体差异性等因素的影响,胃癌患者对化疗药物敏感性降低,产生耐药的现象逐渐增多,使得化疗耐药成为影响胃癌患者预后的重要因素之一。然而,患者是否对某一药物耐药目前还没有有效的评判标准,使得耐药判断呈现滞后性高、无法及时寻找替代药物等特点。随着化疗耐药的研究不断深入,越来越多的证据表明胃癌患者化疗耐药的发生常与癌基因或抑癌基因的表达改变、癌细胞的药物代谢和抵抗作用以及患者反复多次用药等因素相关。我们的前期研究证明,胰岛素增强子结合蛋白1(Insulin gene enhancer binding protein 1,ISL1)在胃癌中异常表达,ISL1不仅参与胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,还可以作为判断genetic interaction胃癌患者预后的重要指标,说明ISL1与胃癌的发生发展有密切的关系。但ISL1对胃癌中的化疗敏感性的影响以及具体机制目前还未见报道。【目的】本研究旨在探究ISL1对胃癌细胞化疗敏感性的影响,并尝试阐述ISL1调控化疗敏感性的具体分子机制。【方法】1.通过免疫组化检测化疗(或铂类)耐药/VX-661细胞培养敏感患者的肿瘤组织中ISL1的表达,并联系临床病理特征分析ISL1与胃癌患者化疗(或铂类)耐药的关系。2.通过Western blot、RT-q PCR实验检测胃癌细胞系MGC803、MKN45、BGC823、AGS、SGC7901和正常胃黏膜上皮细胞系GES1中ISL1的表达水平,筛选ISL1相对高表达和相对低表达的细胞系作为后续的研究体系。3.通过RT-q PCR和Western blot实验检测不同浓度顺铂(0、20、Belnacasan40、60、80、100μM)作用下ISL1的m RNA水平和蛋白水平的表达量。利用CCK8实验检测通过转染ISL1敲低或过表达的质粒后胃癌细胞的顺铂IC50的变化。此外,检测ISL1对顺铂作用下胃癌细胞增殖能力的影响,综合分析ISL1与顺铂敏感性的关系。4.对敲低ISL1的胃癌细胞CHIP-seq的差异基因数据集进行GO分析和KEGG pathway富集分析,定位ISL1参与胃癌耐药的相关机制。根据ISL1参与胃癌耐药机制的结果,进行ISL1与自噬的关系验证。利用MDC染色、m GFP-RFP-LC3荧光以及Western Blot检测自噬指标蛋白联合监测ISL1作用下胃癌细胞自噬流的变化情况,同时利用自噬调节剂进行回复。利用自噬调节剂处理ISL1敲低/过表达稳转胃癌细胞研究胃癌细胞增殖能力的变化。结合上述实验,综合分析ISL1对胃癌细胞自噬流的影响。5.对顺铂处理后的两株胃癌实验细胞进行自噬的检测,分析顺铂对胃癌细胞自噬的影响。ISL1敲低或过表达的同时联合自噬调节剂,观察此时胃癌细胞IC50的变化,以及在ISL1的改变、自噬调节剂的加持下,检测顺铂抑制胃癌细胞增殖的能力,分析是否产生差异性的改变。结合以上实验,分析ISL1是否通过促进保护性自噬抑制胃癌细胞顺铂敏感性。6.利用自噬相关基因PCR array和Chip-seq数据联合分析ISL1可能调控的下游基因,并探究ISL1能否结合到ATG9B的转录增强子区域,并寻找结合位点。同时对ISL1敲低或过表达,利用RT-q PCR、Western Blot分析ATG9B m RNA水平以及蛋白水平的表达变化。【结果】1.通过免疫组化及临床病理分析结果发现ISL1高表达的胃癌患者发生化疗(或铂类)耐药的可能性增加,同时通过RT-q PCR、Western Blot检测发现ISL1表达丰度与胃癌细胞顺铂敏感性呈负相关。此外,通过IC50检测发现ISL1的高表达可以降低胃癌细胞对顺铂的敏感性,从而提高胃癌细胞对于顺铂的抵抗效应。2.通过GO分析和KEGG pathway富集分析,我们分析ISL1的表达与细胞对外界的刺激反应有关,该数据集内自噬相关基因占半数,同时ISL1还与自噬前驱通路PI3K/AKT相关。因此我们将研究机制定位至胃癌细胞的自噬过程。通过MDC染色、m GFP-RFP-LC3荧光以及Western Blot检测自噬指标蛋白联合检测,发现ISL1表达升高使自噬小体、自噬指标蛋白表达增加;而ISL1表达降低,使自噬小体、自噬指标蛋白表达随之降低,同时自噬调节剂在ISL1表达改变的影响下无法有效发挥原本的作用。3.通过IC50检测发现,过表达ISL1可以降低胃癌细胞的顺铂敏感性,联用自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)后可以使敏感性进一步降低;而联用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)细胞的敏感性被部分恢复,有所增强。相反的,敲低ISL1可以增强胃癌细胞的顺铂敏感性,联用3-MA可以进一步增强胃癌细胞顺铂敏感性,联用Rapa则降低胃癌细胞的顺铂敏感性。而CCK8增殖实验结果显示,顺铂能够有效抑制胃癌细胞的增殖。Rapa部分恢复顺铂作用下胃癌细胞的增殖能力,而过表达ISL1后,Rapa的作用得到进一步加强;敲低ISL1后,Rapa无法有效恢复顺铂作用下胃癌细胞的增殖能力。3-MA可以增强顺铂抑制胃癌细胞增殖的作用,即3-MA发挥了促敏顺铂的作用,敲低ISL1后,3-MA的顺铂促敏作用被进一步增强;过表达ISL1后,3MA的顺铂促敏作用被部分抑制,胃癌细胞的增殖能力有所恢复。4.通过RT-q PCR、Western Blot、Chip-seq结果联合分析提示,自噬相关蛋白9B(Autophagy Related 9B,ATG9B)有可能是ISL1的下游靶基因,ISL1可能直接结合在ATG9B基因的增强子区,促进其m RNA的表达,但对ATG9B蛋白水平表达调控作用不明显。【结论】1.ISL1在癌组织和细胞系中异常高表达,ISL1高表达的胃癌患者发生化疗耐药及铂类耐药可能性增加。ISL1通过促进细胞的保护性自噬来降低胃癌细胞的顺铂敏感性,从而提高胃癌细胞对顺铂的抵抗能力,且ISL1的表达与顺铂浓度呈负相关。2.ISL1促进胃癌细胞自噬的发生,主要体现在自噬的启动和激活阶段,且ISL1对自噬的调节作用可能通过ATG9B介导的。