背景:学习和记忆功能障碍是许多神经系统疾病的共性,海马是其最重要的脑区之一,其中海马体神经环路中的蛋白结构和功能紊乱在学习和记忆功能障碍发生发展中发挥重要作用。泛素蛋白酶体途径(UPS)是真核生物体内最重要的蛋白质降解途径之一,其中泛素蛋白连接酶E3在UPS时识别目标蛋白过程中起关键作用。Kip1泛素-促进复合体(KPC)是一种E3复合体,由KPC1和KPC2组成。KPC1的C端含有一个环指结构域作为催化亚基,以此识别并降解底物蛋白,是Peri-prosthetic infectionE3不可缺少的组成部分。在神经元,钙反应性反式激活子(CREST)介导钙内流诱导的基因转录,并以此参与神经干细胞分化。我们前期发现,KPC1基因敲除鼠学习、记忆等认知功能较同年龄小鼠明显增强,且海马组织CREST蛋白水平显著增多,但机制至今不明。目的:揭示KPC1通过UPS调节CREST蛋白稳定性而影响海马神经元介导学习和记忆等认知功能的selleckchem MK-2206作用与机制。方法:以WT小鼠、KPC1基因敲除小鼠为动物实验材料,在不同年龄段以Morris水迷宫实验和新事物认知实验评价小鼠学习、记忆、认知等行为学功能,应用Western blot检测上述小鼠海马组织蛋白中CREST的蛋白水平。以小鼠海马神经元细胞系(HT22)为细胞实验材料,在转染过表达/敲低KPC1腺病毒后,应用Real-Time PCR和Western blot检测转染效率以及转染后CREST的表达变化;在HT22细胞中转染KPC1敲低腺病毒后,采用细胞免疫荧光法染色观察HT22细胞突起长度及数目变化,同时Western blot检测神经元突起标志物MAP2蛋白水平变化;利用免疫共沉淀Co-IP技术检测HT22细胞中内源性KPC1和CREST的相互作用;在HT22细胞中分别转染表达融合3×Flag的KPC1和表达融合3×HA的CREST质粒,用抗HA磁珠免疫沉淀IP反应后,利用Western blot检测CREST的泛素化水平;利用Aβ1-42干预的阿尔兹海默症细胞模型,转染KPC1敲低腺病毒后评价其特征变化。结果:(1)Morris水迷宫和新事物认知实验结果显示:KPC1基因敲除小鼠学习、记忆、认知等行为学能力较WT小鼠显著提升,尤其在6、18月龄的中老年小鼠差异更为显著;(2)Western blot检测显示:各年龄段KPC1基因敲除小鼠海马组织中CREST的蛋白水平较WT小鼠均有不同程度升高,尤其在海马发育阶段的1月龄、3月龄升高趋势更为显著;(3)RT-PCR和Western blot显示:在HT22细胞,转染敲低KPC1腺病毒后,CREST蛋白水平显著增高,而KPC1过表达则降低其蛋白水平;(4)细胞免疫荧光法染色结果显MLN4924供应商示:在HT22细胞,转染敲低KPC1腺病毒后,HT22细胞突起长度及数目均增加;Western blot检测发现CREST和神经细胞突起标志物MAP2蛋白水平明显增加;(5)免疫共沉淀Co-IP实验结果显示:在HT22细胞,KPC1和CREST具有内源性相互作用;(6)免疫共沉淀实验及Western blot结果显示:在共转染KPC1与CREST的HT22细胞,显著提高CREST蛋白泛素化水平的同时明显降低CREST蛋白水平;(7)KPC1敲低部分改善AD细胞模型的典型变化:将KPC1敲低腺病毒转染于以Aβ1-42干预的经典AD细胞模型,Western blot结果显示:在AD细胞模型,敲低KPC1显著降低Aβ1-42和p-Tau蛋白水平。结论:KPC1通过泛素化CREST蛋白促进其降解,减少海马神经元突起数目和长度,以此调节学习和记忆等认知功能。