研究背景和目的紫外线辐射与许多皮肤疾病的发病机制和病情加重密切相关,过量的紫外线辐射诱发皮肤急性炎症反应,如日晒伤。中波紫外线(UVB)的穿透力较低,在UVB照射后,组织损伤主要集中在表皮层。作为表皮中的主要构成细胞,角质形成细胞积极参与维持皮肤组织中微环境的平衡。细胞死亡是皮肤遭受UVB辐射损伤后,角质形成细胞发生的关键事件之一。长期以来,细胞凋亡一直是暴露于UVB辐射的皮肤角质形成细胞中唯一被发现的一种调节性细胞死亡方式。近期,包括我们课题组在内的研究表明,UVB辐射可以诱导角质形成细胞发生GSDME介导的焦亡。同时,我们的前期研究观察到,局部应用二甲双胍对UVB引起皮肤损伤中的角质形成细胞死亡有保护作用。然而,二甲双胍是否对于UVB引起的不同类型的调节性细胞死亡均起到保护作用尚不清楚。已有研究显示miR-133a-3p参与炎症性皮肤病(如银屑病、特应性皮炎)的发病,同时miR-133a-3p也被发现参与了细胞凋亡、GSDMD介导的焦亡等过程。然而,目前仍不清楚miR-133a-3p是否在UVB辐照后对角质形成细胞中同时发生的凋亡和焦亡进行共同调控。本研究旨在明确miR-133a-3p在角质形成细胞暴露于UVB辐照后的差异表达,并探究miR-133a-3p调控UVB辐照后角质形成细胞发生凋亡和GSDME介导焦亡的机制及二甲双胍对该过程的调控。研究方法1.建立UVB辐照诱导小鼠皮肤发生急性光损伤的模型,同时,局部外用0.6%的二甲双胍乳膏进行治疗,观察小鼠皮肤损伤情况并评分;H&E染色检测局部皮肤组织和细胞形态,测量表皮厚度;实时荧光定量PCR检测miR-133a-3p的水平在各组间的表达差异;RNA原位杂交检测miR-133a-3p在各组间的表达及定位。并探究角质形成细胞是否发生凋亡和GSDME介导的焦亡,Western blot检测小鼠暴露皮肤的表皮中,凋亡和GSDME介导的焦亡标志性蛋白的水平;免疫荧光检测局部皮肤组织中cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平及定位。2.在UVB辐照诱导小鼠皮肤发生急性光损伤的模型中皮内注射agomir miR-133a-3p,观察小鼠皮肤损伤情况并评分;H&E染色检测局部皮肤组织和细胞形态,测量表皮厚度。进而探究角质形成细胞的死亡是否受到miR-133a-3p抑制,TUNEL染色检测局部皮肤组织中表皮细胞的总体死亡水平;Western blot检测小鼠暴露皮肤的表皮中,凋亡和GSDME介导的焦亡标志性蛋白的水平。3.建立UVB辐照诱导体外人角质形成细胞系HaCaT细胞死亡的模型,同时,设置辐照后加入二甲双胍的处理组作为抑制获悉更多HaCaT细胞死亡的对照,台盼蓝染色检测细胞的总体死亡水平;Western blot检测细胞中凋亡和GSDMPulmonary infectionE介导的焦亡标志性蛋白的水平;实时荧光定量PCR检测细胞中miR-133a-3p的水平;HaCaT细胞与THP-1细胞共培养,检测THP-1细胞贴壁的水平。4.在 HaCaT 细胞中转染 miR-133a-3p mimic 或 inhibitor,探究 miR-133a-3p 对UVB辐照诱导HaCaT细胞死亡的影响;在转染miR-133a-3p inhibitor的UVB辐照HaCaT细胞中加入二甲双胍,验证miR-133a-3p是否参与二甲双胍的细胞死亡保护效应。Western blot检测上述体系中凋亡和GSDME介导的焦亡标志性蛋白的水平。5.生物信息学预测miR-133a-3p可能的目标靶分子,进行双荧光素酶Compound 3作用报告基因实验验证靶分子CYLD。在HaCaT细胞中转染miR-133a-3p mimic或inhibitor,实时荧光定量PCR和Western blot检测miR-133a-3p水平改变对CYLD表达的影响。在agomir miR-133a-3p治疗的UVB辐照小鼠模型中,Western blot检测小鼠暴露皮肤的表皮中CYLD蛋白水平。在HaCaT细胞中转导含有shRNA的慢病毒敲降CYLD,以及在CYLD敲降的HaCaT细胞中转染miR-133a-3p inhibitor,验证CYLD是否参与miR-133a-3p对UVB辐照细胞死亡的保护效应,Western blot检测上述体系中凋亡和GSDME介导的焦亡标志性蛋白的水平。研究结果1.UVB辐照诱导小鼠发生急性皮肤损伤,在局部应用二甲双胍治疗后好转。表皮中miR-133a-3p的水平在UVB辐照后降低,局部应用二甲双胍治疗后恢复。UVB辐照诱导表皮角质形成细胞发生凋亡和GSDME介导的焦亡,在局部应用二甲双胍治疗后被抑制。2.皮内注射agomirmiR-133a-3p缓解了 UVB辐照小鼠引起的皮肤急性光损伤,降低了表皮角质形成细胞的总体死亡水平,并抑制了角质形成细胞发生凋亡和GSDME介导的焦亡。3.UVB辐照诱导HaCaT细胞发生凋亡和GSDME介导的焦亡,伴随HaCaT细胞中miR-133a-3p的水平下降,同时可以诱导与HaCaT细胞共培养的THP-1单核样悬浮细胞发生贴壁,这些效应在二甲双胍处理后被抑制。4.miR-133a-3p的高表达或抑制分别减少或促进UVB辐照诱导HaCaT细胞发生凋亡和GSDME介导的焦亡。在miR-133a-3p抑制的HaCaT细胞中,二甲双胍处理对UVB诱导凋亡和GSDME介导的焦亡的保护效应被抑制,提示miR-133a-3p参与二甲双胍的细胞死亡保护效应。5.miR-133a-3p与CYLD 3′-UTR区域结合。miR-133a-3p的高表达或抑制分别减少或促进HaCaT细胞中CYLD的表达。皮内注射agomir miR-133a-3p减少了表皮CYLD的表达。在CYLD敲降的HaCaT细胞中,miR-133a-3p抑制对UVB诱导凋亡和GSDME介导的焦亡的加重效应被抑制。结论1.miR-133a-3p在UVB辐照的皮肤组织表皮中降低,恢复miR-133a-3p的水平可以减轻UVB引起的皮肤损伤。2.在UVB引起的皮肤损伤中,miR-133a-3p同时抑制角质形成细胞发生凋亡和GSDME介导的焦亡,并参与二甲双胍对细胞死亡的保护作用。3.CYLD是miR-133a-3p的靶分子之一,参与miR-133a-3p抑制UVB引起的角质形成细胞凋亡和GSDME介导焦亡的效应。