研究背景:二型糖尿病(Type 2 diabetes,T2DM)是以胰岛素分泌相对不足、胰岛素抵抗和血糖增高为特征的慢性代谢性疾病。胰岛素抵抗是T2DM最主要的发病因素,胰岛β细胞通过代偿性分泌胰岛素维持机体正常的血糖水平。而胰岛β细胞失代偿将导致内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)、氧化应激、自噬流抑制、细胞焦亡,并最终导致胰岛素分泌功能障碍以及细胞凋亡。脂毒性是导致T2DM中胰岛β细胞损伤的主要原因,高浓度的游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)导致胰岛β细胞生理代谢紊乱,最终诱导功能障碍甚至死亡。一型糖尿病(Type 1 diabetes,T1DM)是一种免疫系统缺陷疾病,自身免疫抗体损伤胰岛β细胞,导致胰岛素分泌绝对缺乏。T2DM和T1DM的中末期普遍存在胰岛β细胞死亡,伴随细胞功能障碍,但相关分子机制仍需进一步讨论。丝裂原活化蛋白激酶5(Mitogen activated protein phosphatase 5,MKP-5)作为MAPK家族负向调控因子,参与到免疫调节与肺纤维化等疾病中,但MKP-5在糖尿病胰岛β细胞中的作用仍需进一步探索。研究目的:1.本研究以MKP-5基因为靶点,利用胰岛β细胞系和小鼠的原代胰岛细胞中探讨MKP-5对脂毒性损伤的影响。2.探讨并比较MKP-5基因敲除对T2DM和T1DM小鼠的糖脂代谢紊乱和胰岛β细胞损伤的影响。3.分析MKP-5基因敲除后胰岛细胞差异基因变化,探讨MKP-5调节糖尿病小鼠胰岛细胞损伤的分子机制。研究方法和结果:1、MKP-5调控胰岛β细胞的脂毒性损伤Real-time PCR和Western blot结果表明,MKP-5过表达显著抑制棕榈酸(Palmitic acid,PA)对Rin-m5f胰岛β细胞炎症、氧化应激、ERS和凋亡的激活,并缓解对细胞增殖的抑制。利用ELISA进行葡萄糖刺激胰岛素分泌实验(Glucose-stimulated insulin secretion,GSIS),与Real-time PCR和Western blot结果共同表明,MKP-5能缓解PA诱导的Rin-m5f细胞中胰岛素分泌功能障碍。而利用si-RNA敲降Rin-m5f细胞中MKP-5则加剧了PA诱导的线粒体途径的凋亡、ERS以及胰岛素分泌功能障碍。肥胖小鼠原代胰岛细胞中MKP-5的表达水平显著下降,凋亡和ERS相关蛋白的表达显著增加,而胰岛β细胞的功能蛋白表达受到抑制。MKP-5过表达/抑制表达能缓解/加剧脂毒性诱导的原代胰岛细胞损伤过程。MKP-5缓解PA诱导的MAPK通路的活化,JNK与P38抑制剂能分别缓解MKP-5调控PA诱导的胰岛β细胞线粒体途径凋亡和功能损伤。2、MKP-5敲除对糖尿病小鼠代谢异常和胰岛细胞损伤的影响MKP-5敲除促进T2DM小鼠体重进一步增加、T1DM小鼠体重进一步降低,也加剧了T2DM和T1DM小鼠的高血糖。腹腔内注射葡萄糖耐量实验(Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)和腹腔内注射胰岛素耐量实验(Intraperitoneal insulin tolerance test,IPITT)表明,MKP-5敲除后加剧了糖尿病selleck抑制剂小鼠的葡萄糖耐受损伤和胰岛素抵抗。此外,MKP-5敲除后T2DM和T1DM小鼠部分血脂指标进一步恶化。免疫组化和ELISA实验显示,MKP-5敲除加剧了STZ注射小鼠胰岛中免疫细胞的浸润和血清中炎症因子的释放。HE染色显示,MKP-5敲除进一步增加高脂饮食(High fat diet,HFD)饲养小鼠胰岛的尺寸,也进一步抑制STZ注射小鼠原代胰岛的尺寸。免疫组化显示,MKP-5敲除后降低HFD饲养雄性小鼠的胰岛素强度/胰岛面积,对雌性小鼠的上述比值无影响。MKP-5敲除降低了STZ注射后小鼠胰岛中胰岛素强度/胰岛面积。此外,在MKP-5 KO HFD雌性小鼠中,胰高血糖素强度/胰岛面积进一步升高,而MKP-5敲除对STZ注射后小鼠胰岛中高血糖素强度/胰岛面积无明显影响。GSIS结果显示,无论正常饮食(Chow)还是HFD饲养的小鼠,MKP-5敲除后其血清胰岛素水平显著增加。同时MKP-5敲除进一步加剧了STZ对原代胰岛GSIS的抑制。Western blot与免疫荧光结果显示,HFD可上调WT小鼠胰岛细胞中凋亡相关蛋白的表达,而STZ注射则对其无影响。与WT小鼠相比,无论是HFD还是STZ处理时,MKP-5 KO小鼠胰岛内凋亡蛋白表达水平均显著增加。在WT小鼠胰岛中,HFD增加cleaved GSDMD表达,STZ注射增加了cleaved Caspase-1和cleaved GSDMD表达。值得注意的是,在MKP-5 KO的处理组小鼠胰岛中,上述焦亡相关蛋白均大幅增加。在WT小鼠胰岛中,HFD仅增加了p-JNK/JNK的水平,对p-P38/P38和p-ERK/ERK无影响,但其表达水平均在MKP-5 KO HFD组中显著增加。STZ注射WT小鼠胰岛后p-ERK/ERK显著增加,但对p-P38/P38和p-JNK/JNK无影响。而在MKP-5 KO STZ组中,上述比值均显著增加。3、MKP-5通过GRP-78缓解胰岛β细胞脂毒性损伤和自噬抑制转录组测序结果表明,WT与MKP-5 KO小鼠胰岛细胞中自噬、ERS、胰岛素通路、能量代谢等通路存在差异。Western blot表明,在MKP-5敲降后,HFD饲养小鼠的原代胰岛中LC3-Ⅱ、p-m TOR蛋白表达进一步增高,p-AMPK和Beclin-1蛋白表达进一步抑制,而在MKP-5敲降后,STZ注射进一步抑制p-AMPK和Beclin-1蛋白的表达,对其他自噬蛋白无影响。免疫荧光结果显示,HFD抑制了WT小鼠胰岛β细胞中Beclin-1蛋白的表达,STZ则无上述作用,但MKP-5 KO未能进一步抑previous HBV infection制HFD饲养小鼠胰岛β细胞中Beclin-1表达。激光共聚焦显微镜、透射电镜和Western blot结果共同证实,MKP-5过表达可缓解脂毒性诱导的胰岛β细胞内自噬流抑制。此外,MKP-5可缓解自噬抑制剂3-甲基嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)与PA诱导Rin-m5f细胞的凋亡、ERS、氧化应激和功能蛋白的抑制。在Rin-m5f细胞中敲降自噬调节基因AMPK后,MKP-5不再缓解PA对胰岛β细胞自噬和功能蛋白表达的抑制。荧光素酶报告基因实验表明,MKP-5可能通过调控AMPK转录水平发挥上述调节作用。与转录组测序结果相一致,葡萄糖调节蛋白-78(Glucose regulation protein78,GRP-78)在MKP-5 KO小鼠胰岛细胞中表达量显著增加。MKP-5 KO加剧HFD饲养小鼠胰岛细胞中GRP-78和ERS蛋白表达。而STZ注射WT小鼠后GRP-78与ERS蛋白表达无变化。因此本研究构建了Retro Q-sh GRP78逆转录病毒,发现其在抑制原代胰岛细胞自噬基因AMPK的基础上,又通过抑制了自噬小体合成加剧了脂毒性对Rin-m5f细胞自噬流的抑制。此外,sh GRP-78加剧了MKP-5 KO HFD组中ERS、细胞焦亡、凋亡蛋白水平增加,进一步抑制了Ferrostatin-1纯度胰岛β细胞功能蛋白表达水平。最后Co-IP实验提示,MKP-5蛋白可能通过与GRP-78蛋白结合,从而缓解胰岛β细胞的脂毒性损伤。结论:(1)MKP-5敲除加剧T1DM和T2DM小鼠糖脂代谢紊乱和胰岛细胞功能异常。(2)MKP-5通过AMPK调控的自噬,部分缓解胰岛β细胞的脂毒性损伤。(3)MKP-5通过内质网分子伴侣GRP-78缓解胰岛β细胞自噬流抑制和脂毒性损伤。